Identificação por ultrafiltração acoplada à CLUE-EM de ligantes enzimáticos de apirase a partir de fontes naturais e avaliação da sua atividade esquistossomicida in vitro e in vivo - Carvalho, Lara Soares Aleixo de (2020)
O presente trabalho descreve a identificação de ligantes naturais da enzima apirase de batata, os quais podem ser potenciais substâncias esquistossomicidas, por meio da ultrafiltração (UF) acoplada à CLUE-ESI-QTOF-EM. Avaliou-se também a atividade esquistossomicida in vitro e in vivo de extratos vegetais selecionados e substâncias isoladas. Primeiramente, a cardamonina, substância com atividade esquistossomicida in vitro e com potencial de inibição da atividade das ATP difosfohidrolases, foi avaliada frente à sua atividade esquistossomicida in vivo e utilizada para selecionar as condições de incubação para a técnica de UF. Em seguida alguns extratos produzidos foram incubados com a apirase de batata e submetidos à UF acoplada a CLUE-ESI-QTOF-EM. Os picos cromatográficos dos ligantes da apirase foram selecionados para posterior fracionamento dos extratos vegetais e isolamento e purificação destas substâncias ligantes. As substâncias isoladas foram avaliadas frente à enzima apirase de batata e em ensaios esquistossomicidas in vitro e in vivo. Os resultados deste estudo demonstram que a cardamonina possui capacidade de se ligar e inibir a atividade enzimática da apirase de batata, apresentando IC50 de 49 M. Além disso, em modelo murino, a cardamonina (400mg/kg) foi capaz de reduzir em 46,81% o número total de vermes recuperados e 62,44% o número de ovos imaturos. Como resultado dos ensaios de UF acoplada à CLUE-ESI-QTOF-EM, o screening de amostras para seleção de potenciais ligantes e inibidores da enzima apirase de batata resultou na seleção de 3 extratos vegetais das espécies Ruta graveolens L. (Rutaceae), Acmella oleracea L. (Asteraceae) e Centela erecta L. (Apiaceae). Destes extratos isolaram-se os ligantes arborinina, espilantol e asiaticosídeo, respectivamente. Em relação à atividade enzimática, quando avaliados a 25 M, a arborinina, o espilantol e o asiaticosídeo foram capazes de inibir a enzima em 31,32%, 77,29% e 33,23%, respectivamente. No estudo esquistossomicida in vitro a fração Rg-F4, oriunda do extrato de R. graveolens, e o extrato de A. oleracea, causaram a morte de todos os parasitos após 24h e 48h de incubação. O extrato de C. erecta (100 μg/mL) causou a morte somente dos vermes machos, enquanto as fêmeas tiveram apenas pequena redução da atividade motora, após 24h de incubação, sendo todos os parasitos mortos após 48 h de incubação. O espilantol (100 μM) causou a morte de todos os parasitos após 24 h de incubação. Já o asiaticosídeo (400mg/kg), quando avaliado no ensaio esquistossomicida in vivo, foi capaz de reduzir em 65,43% o número de vermes recuperados e, em 67,87% o número de ovos por grama de fezes. Os resultados obtidos neste estudo com a cardamonina sugerem que a apirase pode ser utilizada como molécula alvo em estudos de triagem para encontrar ligantes e possíveis inibidores das ATP difosfohidrolases de S. mansoni, a partir de extratos vegetais. Além disso, torna-se importante estudos adicionais para a investigação da atividade esquistossomicida in vivo da arborinina e do espilantol.