Síntese e caracterização de nanopartículas de quitosana para aplicação em transfecção celular - Guimarães, Judith Maria de Oliveira (2019)
A abordagem da engenharia genética em animais envolve diversos tipos de tecnologias direcionadas para a produção de Animais Geneticamente Modificados (AGMs). Uma etapa essencial para a produção de AGM consiste no carreamento in vitro de material genético em células somáticas. Contudo, as técnicas desenvolvidas para o carreamento gênico não têm sido eficientes devido as falhas na transfecção e integração do transgene que estão relacionados a diversos fatores. Atualmente, novas alternativas surgiram para a entrega eficiente de DNA exógeno, como a utilização de nanocarreadores, devido sua capacidade de interação com material genético e internalização celular. O objetivo deste estudo é sintetizar e caracterizar nanopartículas (NPs) de quitosana visando aplicações em transfecção de células somáticas. A síntese da NP de quitosana foi realizada pelo método de gelificação iônica. O plasmídeo utilizado foi o PEF- GFP clonado na E. coli stbl3 e purificado seguindo o protocolo do kit QIAprep® Spin Maxprep. As NPd foram caracterizadas pela técnica de DLS que revelou uma variação de tamanhos de acordo com as proporções utilizadas desde nanopartículas com 117,7nm a 313,9nm. Dentre os tratamentos testados, optou-se pela proporção de 6/1/1 com NP livres variando o diâmetro médio de 124,7 a 142,7 nm para a realização dos ensaios de transfecção. O nanocomplexo contendo DNA plasmidial/TPP/NPs de quitosana apresentou diâmetro variando de 387,2nm e 284,4nm e o nanocomplexo DNA plasmidial/ NPs de quitosana apresentou diâmetro variando de 351,9nm e 369,7nm. Foram realizados vários ensaios de transfecção alterando produção de NPs com e sem TPP, tempo de exposição, pH, potencial Zeta e uso de meios DMEM ou PBS/SFS. O tratamento em que os nanocomplexos foram preparados com TPP, usando PBS/ SFB, pH 6,5 e as células HEK 293 ficaram expostas por 24 horas aos nanocomplexos apresentaram uma melhor eficiência de transfecção (8,25%) em relação aos outros tratamentos. Portanto, os resultados demonstraram que o pH e o tempo de exposição aos nanocomplexos influenciam na taxa de transfecção celular utilizando NP de quitosana.