Processamento de amostras fixadas em formalina e preservadas em parafina para uso diagnóstico e caracterização de doenças através de biologia molecular - Oliveira, Marcelo Zvir de (2022)
Os avanços científicos voltados ao diagnóstico clínico e o surgimento da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), fizeram com que amostras biológicas fixadas em formalina e preservadas em parafina, as chamadas FFPE (do inglês formalin-fixed paraffin-embedded) se tornassem fontes valiosíssimas de material genético para análises moleculares na complementação de diagnósticos clínicos. O grande desafio a partir de então, se dá frente à utilização de protocolos que sejam eficazes diante da recuperação e amplificação do DNA. O objetivo do estudo foi padronizar o uso de material (FFPE) proveniente de processos patológicos diversos, representativos das doenças humanas, para uso na investigação molecular. Trata-se de um estudo transversal retrospectivo, no qual foram incluídas amostras com tempo de preservação em parafina distintos, provenientes do Laboratório de Patologia do Hospital São Vicente de Paulo, Passo Fundo, RS e do Laboratório de Patologia da UNESP – Botucatu, SP. As amostras de diferentes tecidos (tumoral e não tumoral), distribuídas em dois grupos conforme fixador, Grupo 1 (G1 - formalina não tamponada, n=90) e Grupo 2 (G2 - formalina tamponada, n=68) foram seccionadas em micrótomo (3 e 6 cortes de 10 micrômetros (μm) – G1 e 6 cortes de 10 micrômetros (μm) – G2), e o período de preservação das amostras foi de 2, 5 e 10 anos. Posteriormente, as amostras seccionadas foram submetidas à desparafinização e extração de DNA total e analisadas por espectrofotometria para verificação da qualidade e quantidade do DNA recuperados de cada tecido. A eficiência da recuperação de DNA foi confirmada pela amplificação do gene endógeno beta globina por PCR, utilizando-se primers específicos. Os dados foram analisados seguindo os pressupostos estatísticos e o nível de significância adotado foi de 5%. Observou-se que a concentração de DNA Total isolada de amostras de períodos de 2, 5 ou 10 anos não foi diferente. A Concentração de DNA total foi inferior nas amostras de biópsias (G1 e G2) comparadas às peças cirúrgicas (G1 e G2) (p<0,0001), no entanto esse resultado foi inverso quando considerado a concentração de DNA/área do fragmento (G1, p=0,003 e G2, p=0,0005). Em relação à qualidade do DNA observou-se melhor resultado nas amostras de bióspias (G1 e G2) em relação às peças. Considerando a relação >1,8, o número de Biópsias e Peças do G2 foram superiores em relação ao G1. Quanto à positividade da PCR, a taxa de sucesso da amplificação do gene endógeno beta globina foi de cerca de 70% no G1 e 100% no G2. Para as amostras de Biópsias (G1) 6 cortes, observou-se maior positividade comparadas às de 3 cortes (p=0,04). Conclui-se que o tempo de armazenamento de amostras FFPE não interfere na quantidade de DNA recuperada. O uso de formalina tamponada é preferível frente para a fixação dos tecidos. As biópsias FFPE para obtenção de DNA apresentam maior quantidade de DNA/área e melhor qualidade de DNA, sendo seu uso preferível em relação às peças, no entanto um número maior de cortes (material) se apresentou mais eficaz frente à recuperação e positividade diante as Biópsias conservadas em formalina comum. O protocolo de extração de DNA de fácil execução e econômico é factível para as análises moleculares de um grande número de amostras FFPE, mas faz-se necessário conhecer todas as variáveis que podem interferir na recuperação do material genético.