Caracterização molecular e perfil fermentativo de leveduras epífitas isoladas de frutos in natura para seleção de linhagens com potencial para produção de cerveja - Silva, Frederico Medeiros Rosas da (2023)
Desde o controle dos processos de fermentação alcoólica, leveduras do gênero Saccharomyces se mostram excelentes para a produção de cerveja que se popularizaram no início do século XX. No entanto, o interesse em novas linhagens de leveduras vem aumentando, para atender a demanda de um mercado atual em transição, com aumento de microcervejarias locais, dedicadas à criação de cervejas mais autênticas e com características sensoriais diferenciadas e complexas. Por conta da diversidade ambiental brasileira, supõe-se que o isolamento de diferentes linhagens de leveduras com potencial fermentativo e com produção peculiar de metabólitos secundários possa fornecer sabores e aromas diferenciais na cerveja. Este trabalho objetiva, a partir do isolamento, identificar e analisar o perfil fermentativo de linhagens de leveduras epífitas de frutos para seleção de linhagens adequadas para produção de cerveja com características sensoriais diferenciadas. Para isso, cento e nove (109) amostras de ocasião de frutos in natura foram coletadas com material estéril, obtendo-se 161 colônias sugestivas de leveduras. Trinta e nove (39) foram excluídas por, microscopicamente, apresentarem-se impuras e 31 por não apresentarem crescimento adequado em meio líquido. Assim, 91 colônias puras com morfologia leveduriforme foram isoladas, submetidas à identificação fenotípica, estocadas e analisadas quanto à atenuação da densidade, variação de pH e aroma preliminar em fermentação de mosto cervejeiro. Em 26 isolados (28,6%), não foi possível a identificação fenotípica, porém, 31 (34,1%) foram identificados como S. cerevisiae, além de outras 9 diferentes espécies classe I de risco biológico. Treze isolados (14,3%) foram descartados por pertencerem ao grupo de risco biológico classe II. A identificação molecular (reação em cadeia da polimerase e sequenciamento da região ITS do gene do RNA ribossômico 5.8S) foi capaz de identificar 8 isolados não identificados pela metodologia fenotípica, todas não-Saccharomyces, dentre eles, quatro isolados do Filo Basidiomycota. Os isolados apresentaram grande variação na capacidade de atenuação de densidade após 14 dias (de 8% a 94%, média 51,6%), com 43 isolados com atenuação mínima do mosto de 60%. Apenas um isolado de classe II foi capaz de atenuar o mosto em 60% (C. krusei). Em relação à percepção de aroma preliminar, 19 isolados foram considerados diferenciados e 35 comuns, totalizando 54 isolados com aroma adequado. Todos os isolados com aroma diferenciado tiveram confirmação por identificação molecular, nenhuma classe II de risco biológico. A combinação de identificação, atenuação do mosto e perfil de aroma adequados permitiu pré-selecionar 27 isolados adequados para aplicação em fermentações cervejeiras. A análise estatística por regressão logística binária mostrou correlação (OR = 4,4) para coleta de amostras em zona não-urbana com isolamento de leveduras adequadas para fermentação cervejeira. A seleção final de isolados considerados potenciais para produção de cerveja com características sensoriais diferenciadas foi realizada após análise de distanciamento genético por filogenia, busca de genes off-flavors por multiplex-PCR, perfil de aroma diferenciado, exclusão de gêneros de baixa aceitação comercial e acidificação (pH < 4,0, como potencial para produção de cerveja tipo sour). A combinação destes critérios possibilitou a seleção de 6 isolados potencialmente diferenciados, que tiveram a confirmação de fermentação alcoólica no Alcoolyzer Beer(R), que foram divididos em três subgrupos: (i) dois isolados S. cerevisiae distintos geneticamente das linhagens existentes e com aroma diferenciado; (ii) dois isolados não Saccharomyces (Pichia kluyveri; Hanseniaspora uvarum) com acidificação (pH < 4,0) e aroma diferenciados; (iii) dois isolados do Filo Basidiomycota (yeast-like) com acidificação (pH < 4). Os isolados do grupo (ii) foram submetidos à fermentação com variação de parâmetros: taxa de inóculo (1x106 células/mL / 1,5x106 células/mL) e temperatura (20ºC e 25ºC) e a teste de tolerância ao etanol (0, 5%, 10%, 15%, 20% e 25%), junto de linhagens comerciais de leveduras. A combinação de parâmetros com maior atenuação e produção de aroma, para ambos isolados, foi a 25ºC com inóculo de 1x106 células/mL, uma taxa menor do que a indicada para uso em um novo isolado comercial para acidificação em fermentação única, a Lachancea thermotolerans (2x106 células/mL), que também apresenta como desvantagem a necessidade de adição de glicose ao mosto. Ambos isolados testados apresentaram menor variação na capacidade de atenuação, pH e perfil de aroma (frutado cítrico) quando nas variações de temperatura e taxa de inóculo testadas, quando comparado com o isolado comercial. Ambos isolados do subgrupo (ii) apresentaram tolerância ao etanol semelhante à linhagem comercial de S. cerevisiae Safale US-05 ®. Assim, observa-se a viabilidade do isolamento de leveduras ambientais para utilização em fermentação cervejeira, com geração de cerveja com características sensoriais diferenciadas e, em especial, isolados com capacidade de produzir cerveja sour em fermentação única e com aroma diferenciado. A perspectiva é detectar, por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa, os compostos voláteis produzidos pelas linhagens selecionadas.