Enterococos e CRISPR: revisão de literatura e edição gênica de cepas multirresistentes - Cabral, Amanda Seabra (2024)
As bactérias do gênero Enterococcus são membros da microbiota normal do trato gastrointestinal humano e estão comumente relacionadas a infecções relacionadas à assistência à saúde, sobretudo no ambiente hospitalar. A partir da pressão seletiva causada pelo extensivo uso de antimicrobianos pela população, vem ocorrendo um aumento na frequência de resistência a diversos antimicrobianos pelas espécies enterocócicas, como ocorreu com o glicopeptídeo vancomicina, importante no tratamento das doenças relacionadas ao microrganismo. A emergência de fenótipos VRE (Enterococcus resistentes à vancomicina) se dá pela presença de operons, como vanA e vanB, que tornam o uso da droga ineficaz. O sistema CRISPR-Cas, um importante mecanismo de defesa bacteriano contra elementos genéticos móveis invasores, tem sido cada vez mais utilizado como um mecanismo de edição gênica, podendo ser utilizado como uma forma de reconhecer e inativar genes de interesse. Assim, o presente estudo objetiva publicar uma revisão de literatura sobre CRISPR e enterococos, considerando sua ocorrência, estrutura e organização, mecanismos de ação e uso como tecnologia de engenharia genética, além de realizar edição gênica de cepas VRE utilizando a ferramente CRISPR. A partir da leitura e análise dos artigos foi encontrada uma maior prevalência de CRISPR2 (1.190; 60,1%) em enterococos. E. faecalis foi a espécie que apresentou maior ocorrência de CRISPR em seu genoma, com 3.041 elementos CRISPR em 3.195 amostras. Os sistemas CRISPR apresentavam de 1 a 20 espaçadores com tamanho entre 23 e 37 pb e sequências de repetição de 25 a 37 pb. O principal uso da ferramenta de edição foi pelo sistema de interferência CRISPRi realizando knockout de genes-alvo, com a entrega do sistema por meio de plasmídeos. Na segunda parte do projeto, foi realizada a edição gênica de cepas VRE para que se possa verificar a possibilidade de reversão da resistência. Para tal, foram utilizadas 3 amostras clínicas de VRE de Enterococcus faecalis e um controle para o gene vanA para serem testadas com a ferramenta desenhada para reconhecer e inativar os operons vanA, entregue por meio de transformação a partir de eletroporação. Após as técnicas de PCR, sequenciamento e replica plating para confirmação da edição, foi observado que não houve edição do gene vanA. Contudo, estão sendo realizados ajustes no protocolo com resultados preliminares promissores