Implementação do cultivo de células tridimensional para aplicação em virologia - Santos, Adriany Lucas dos (2023)
Os primeiros experimentos com cultivo celular utilizavam fragmentos de tecidos em frascos contendo fluidos animais. Com a evolução das pesquisas, as células passaram a ser cultivadas em suportes planos em monocamadas, conhecido como cultivo de células bidimensionais (2D), e, mais recentemente, em estruturas tridimensionais (3D). No cultivo 3D, as células crescem em um ambiente mais dinâmico e contínuo, mimetizando as condições de crescimento celular in vivo, promovendo a proliferação e a diferenciação celular em ambiente mais fiel quando comparado com a fisiologia humana. Dessa forma, tal tecnologia de cultivo representa uma importante ferramenta no estudo de interação vírus-célula e na pesquisa para o desenvolvimento de medicamentos para diferentes aplicações. Uma outra aplicação do cultivo celular em 3D é o seu uso como modelo alternativo em substituição ao uso de animais de laboratórios. Nas últimas décadas, o Zika vírus (ZIKV) tornou-se uma preocupação mundial devido à sua associação com casos de microcefalia, síndrome de Guillain-Barré e outras complicações neurológicas. A falta de vacina ou tratamento específico contra esse vírus torna necessária a busca de medicamentos específicos. Nessa perspectiva, o objetivo deste trabalho foi padronizar e implementar o cultivo de células 3D para estudos posteriores na área biomédica, inclusive na busca de protótipos promissores com atividade antiviral. Para a produção dos esferoides, suspensões de células Vero (30.000 células) foram adicionadas a placas de cultivo de 96 poços fundo “U” tratadas com diferentes concentrações de agarose, que foram incubadas em agitação orbital a 37 ºC e 5% de CO2. Os diâmetros ortogonais e volumes dos esferoides foram avaliados com auxílio do software Fiji. A viabilidade dos esferoides foi testada por Azul Tripan. A avaliação da citotoxicidade (CC50) da molécula 3h foi realizada em células Vero 2D e 3D por três metodologias diferentes: 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide (MTT), vermelho neutro (VN) e cristal violeta (CV). A quantificação comparativa do ZIKV MR766 na amostra estoque foi realizada pela técnica de Reed Müechen e pela diminuição do volume dos esferoides através do Fiji. Os esferoides produzidos em placas tratadas com 2 g formaram esferas mais compactas, permitindo a sua coleta sem interferência da agarose. O volume dos esferoides aumentou com os dias de crescimento (2,95 a 4,14 mm3) e observou-se esferoides mais viáveis (96%) quando produzidos com células com 24 h de crescimento quando comparado aos preparados com 48 h (80%). A determinação do CC50 da molécula 3h em células Vero 2D foi possível pelas três metodologias propostas, porém em células 3D o resultado não foi conclusivo. O estudo comparativo para quantificação do ZIKV MR766 em células 2D e 3D demonstrou que houve redução do volume dos esferoides na diluição correspondente a dose infectante 50% (ID50), sugerindo que eles podem ser utilizados para determinar o título da amostra viral