Ensaios off-line e em fluxo para a triagem de inibidores da enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase humana por cromatografia líquida de alta eficiência - Ximenes, Isabela Abreu Trindade (2023)
A enzima Purina Nucleosídeo Fosforilase humana (HsPNP) participa da via de recuperação de purinas e está presente em altos níveis nos tecidos linfoides. Ela tem sido considerada um dos alvos terapêuticos mais promissores para células T defeituosas. Portanto, o desenvolvimento de métodos de triagem rápidos e confiáveis para a identificação de inibidores da HsPNP é uma estratégia importante para elaboração de novos fármacos para alcançar a supressão de células T. Dentro deste contexto, neste trabalho é a descrita a imobilização da HsPNP na superfície das partículas magnéticas para monitorar sua atividade através da quantificação cromatográfica direta do produto formado utilizando ensaios off-line e em fluxo. Na abordagem off-line, as partículas magnéticas recobertas com a enzima HsPNP são incubadas com o substrato em microtubos e o produto formado é quantificado através de um método cromatográfico desenvolvido e validado. No sistema em fluxo, as partículas magnéticas contendo a enzima HsPNP imobilizada são aprisionadas dentro de um microtubo e inseridas no sistema cromatográfico o qual fornece a rápida separação cromatográfica do substrato e produto da reação catalisada pela enzima. Os métodos validados foram utilizados para o estudo da estabilidade e obtenção dos parâmetros cinéticos para a enzima imobilizada, assim como para a triagem, identificação e caracterização de inibidores. A enzima imobilizada nas partículas magnéticas reteve sua eficiência catalítica com elevada estabilidade por aproximadamente seis meses em ambos os modelos de ensaio. O derivado de imucilina de quarta geração (DI4G), previamente identificado como inibidor da HsPNP, foi reconhecido e caracterizado como inibidor competitivo através das diferentes abordagens, com valores de IC50 iguais a 13,9 ± 1,3 e 317 ± 26,7 nmol.L-1 nos ensaios off-line e em fluxo, respectivamente. As duas metodologias desenvolvidas apresentam diversas vantagens sobre os ensaios tradicionais em solução, como baixo custo, fácil recuperação da enzima do meio reacional, viabilizando a sua reutilização, e confiabilidade do método por envolver o monitoramento da atividade enzimática através da quantificação direta do produto formado. Além disso, o sistema de cromatografia líquida multidimensional possibilitou a realização de análises rápidas e automatizadas para a identificação e caracterização de novos inibidores. Ambos os métodos foram aplicados na triagem de ribonucleosídeos inéditos e os resultados demonstram a seletividade da HsPNP imobilizada, visto que tais compostos não modularam a atividade enzimática. Portanto, os métodos desenvolvidos podem ser empregados como uma ferramenta valiosa na busca de novos ligantes da enzima HsPNP.