Caracterização bioquímica e molecular de uma 2-cis-peroxirredoxina de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walpers] - Silva, Fredy Davi Albuquerque (2011)
O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walpers] é uma das culturas de grande importância para a região Nordeste, pois representa um dos constituintes básicos da dieta de sua população. Embora a produção venha aumentando anualmente no país, a cultura enfrenta diversos tipos de estresses de natureza biótica e abiótica. Durante condições de estresses, espécies reativas de oxigênio (ROS) são produzidas acima da condição fisiológica, como consequência de alterações do metabolismo. O acúmulo de ROS, em vários tecidos, é nocivo para ácidos nucléicos, proteínas e lipídeos. Sendo assim, a busca de mecanismos que atuem na remoção e controle da produção dessas espécies reativas é de fundamental importância. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar, nos seus aspectos bioquímicos, fisiológicos e moleculares, uma enzima antioxidante de folhas de feijão-de-corda, denominada de 2-cis-peroxirredoxina, que atua reduzindo o peróxido de hidrogênio (H2O2) e hidroperóxidos de alquil, produzindo água ou álcool, respectivamente. A 2-cis-peroxirredoxina purificada de folha de V. unguiculata, nomeada de Vu-2-cis-prx, foi obtida por fracionamento com sulfato de amônio (30-60%), cromatografia de afinidade em matriz de quitina e cromatografia de troca iônica em Resource Q. A Vu-2-cis-prx foi capaz de reduzir hidroperóxidos usando o poder redutor do NADPH e do DTT com auxílio do sistema tioredoxina. Apresentou massa molecular de, aproximadamente, 44 kDa/46 kDa, determinada por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão molecular em coluna Superose 12, respectivamente. Já em condições redutoras, apresentou massa molecular de 22 kDa, indicativo de se tratar de uma proteína homodimérica, formada pelo estabelecimento de pontes dissulfeto intermoleculares. A Vu-2-cis-Prx apresentou pI de cerca de 4,7 e a análise por eletroforese bidimensional, com e sem DTT, revelou que a Vu-2-cis-Prx foi focalizada em vários spots protéicos, indicando diferentes estados de oxidação. Sua sequência N-terminal revelou haver similaridade de 96% com a peroxirredoxina de Phaseolus vulgaris e de Populus tricocarpa, e de 94% com aquelas de Vigna radiata, Pisum sativum, Ricinus cummunis e Nicitiana tabacum, além de um resíduo de cisteína altamente conservado na posição 52 (Cys52). Análises por ESI-Q-TOF MS/MS demonstrou massa molecular e pI de 28,622 kDa/5,18, respectivamente. O espectro de dicroísmo circular e desconvolução em pH 7,0 revelaram que a estrutura secundária é composta de 7,6% de ?-hélice, 39% de folha-?, 22,1% de volta-?, e 31% de padrão não ordenado. A Vu-2-cis-Prx se comportou estável ao calor e apresentou temperatura de desnaturação (Tm) de 74 °C. Apresentou, ainda, ótimo de atividade em pH 7.0 e mudanças estruturais e funcionais em pH 3 e 9. Vu-2-cis-Prx não foi capaz de apresentar atividade antifúngica contra Colletrotrichum gloeosporioides, contudo foi capaz de prevenir a degradação de DNA plamidial por ROS (H2O2). Os transcritos de Vu-2-cis-Prx foram altamente expressos em raízes, caules e folhas e a sequência de seu gene demonstrou 100% de homologia com os ESTs FG931548.1 e FG883990.1 de feijão-de-corda, depositados no NCBI. A sequência putativa de aminoácidos revelou 2 resíduos de cisteína conservados e diversos domínios típicos de membros da subfamília de 2-cis-peroxirredoxinas. Modelagem molecular da Vu-2-cis-Prx revelou que o resíduo de cisteína que participa do sítio-redox, denominada de cisteína peroxidásica, está em um bolso no qual o solvente tem acesso, sendo formado por um motivo “loop-hélice”. A Cys52 foi localizada na primeira volta da hélice rodeada pelos aminoácidos Pro45, Thr49 e Arg128, que são conservados em todas as 2-cis-peroxirredoxinas. Além disso, a Vu-2-cis-Prx se mostrou capaz de formar oligômeros com diferentes estados de oxidação. Em suma, foi descrito aqui, pela primeira vez, a purificação e caracterização de uma 2-cis-peroxirredoxina de feijão-de-corda que, semelhantemente a outros membros desta família, deve desempenhar papel crucial na protecção dos cloroplastos de plantas contra o estresse foto-oxidativo prevenindo, assim, danos ao aparato fotossíntético.