Aplicabilidade de marcadores microssatélites na análise de resposta de populações de Tetragonisca angustula (Apoidea, Hymenoptera) à heterogeneidade de habitats na costa Atlântica - Gurgel, Zafira Evelma da Rocha (2013)
1. As abelhas sem ferrão A tribo Meliponini pertence à família Apidae (Apoidea, Hymenoptera) que se destaca como a mais diversificada e com distribuição mais ampla no mundo (Silveira et al., 2002). Das 19 tribos da sub-família Apinae, Meliponini e Apini agrupam as abelhas com comportamento eusocial, o mais alto nível de organização social (Michener, 2000). As abelhas Meliponini apresentam ampla distribuição nos trópicos de todo o mundo (Michener, 2000). A região neotropical contém o maior número de espécies de meliponíneos apresentando 32 gêneros exclusivos (Camargo e Pedro, 2007) do total de 56 gêneros da tribo distribuídos no mundo (Costa et al., 2003). Essas abelhas são visitantes florais numericamente dominantes em várias formações vegetais, destacando-se particularmente nas florestas tropicais pluviais. Na Mata Atlântica, os meliponíneos aparecem associados especialmente às floradas maciças (mass-flowerings), desempenhando papel central na biologia reprodutiva de árvores do dossel (Ramalho, 2004; Monteiro e Ramalho, 2009). Nos meliponíneos, a reprodução e fundação de uma nova colônia perene são feitas por um conjunto de abelhas (rainha e operárias) e ocorre através de um processo de enxameagem progressiva, com longo período de contato entre colônia mãe e filha, ao contrário da ruptura abrupta observada em Apis (Nogueira-Neto, 1997; Velthuis et al., 1997). As operárias nascidas na colônia mãe passam vários dias abastecendo o novo ninho com materiais de construção (cerúmen) e alimento (Nogueira-Neto, 1997). Esta característica pode limitar a formação de novas colônias aos sítios de nidificação mais próximos ao ninho materno (Batista et al., 2003). Apesar dos meliponíneos apresentarem ampla diversidade de substrato de nidificação a maioria das espécies necessitam de cavidades pré-existentes em ocos de árvores (Roubik, 1989; Michener, 2000; Batista et al., 2003). Por isso, as espécies deste grupo de abelhas podem ser bastante suscetíveis à fragmentação da floresta. A manutenção das abelhas sociais sem ferrão para a conservação da Mata Atlântica se deve à importância dessas abelhas como agentes polinizadores de árvores nativas. A redução brusca dos meliponíneos ocasionadas por desmatamentos ou por ação predatória pode gerar redução na diversidade de espécies destes indivíduos e, consequentemente redução de espécies de plantas dependente destas abelhas (Roubik, 1993). 2. A espécie Tetragonisca angustula A espécie Tetragonisca angustula (Latreille, 1811) é uma das abelhas mais comuns com uma ampla distribuição geográfica na América Tropical (Moure, 2007), apresentando um importante papel na polinização da flora nativa (Oliveira et al., 2004). T. angustula é uma espécie generalista na ocupação dos habitats e também no uso de fontes florais e locais de nidificação (Batista et al., 2003). Adapta-se bem a diversos substratos de nidificação, ocupando cavidades pré existentes em troncos de árvores vivas ou mortas, construções humanas, solo, etc. Ao contrário de espécies de Meliponini mais estreitamente associadas à floresta, T. angustula comporta-se como generalista, ocupando vários hábitats em ambientes modificados, incluindo áreas urbanas (Batista et al., 2003; Ramalho e Batista 2005). 3. Fragmentação do habitat A fragmentação de habitats naturais tem sido uma das causas mais importantes para o decréscimo populacional local e perda de biodiversidade regional. Os fragmentos naturais geralmente formam paisagens em mosaico, onde a dinâmica das populações agora também em mosaico e os processos ecológicos podem estar sob forte pressão de fatores dependentes da escala espacial e das características das matrizes modificadas (Andren, 1994; Wiens, 1995). A Mata Atlântica foi reduzida em mais de 90% da sua extensão original e os fragmentos florestados remanescentes estão pulverizados na ampla área de distribuição (Guedes et al., 2005), de modo que a conectividade funcional se tornou uma variável chave para preservação da biodiversidade. Em áreas como o litoral da Bahia, na porção norte, a maioria dos remanescentes florestados tem menos de 100 ha, e a conectividade funcional é o problema central que atinge as populações de meliponíneos (Ramalho e Batista, 2005). A preservação da biodiversidade em longo prazo na região demanda medidas de maior escala espacial, como os corredores ecológicos (Zaú, 1998). Operacionalmente os corredores estão associados à idéia de conectividade física - ou melhor, da matriz interveniente entre os fragmentos - mas o aspecto relevante é o nível de conectividade funcional alcançada: ou seja, de que forma a estrutura de populações de organismos focais e processos ecológicos associados são afetados nestas escalas espaciais. 4. Marcadores Moleculares O estudo de polimorfismos até a década de 60 foi baseado em variações fenotípicas. Essas eram pouco perceptíveis e limitavam a percepção de diferenças significativas entre as populações (Futuyma, 1992) ou suas respostas sutis às variações espaciais. Ensaios subseqüentes com marcadores moleculares evidenciaram locos polimórficos que não seriam identificados com observações fenotípicas. A primeira técnica utilizada foi a eletroforese de proteínas, desenvolvida por Harris (1966) e Hubby e Lewotin (1966). Os marcadores isoenzimáticos foram muito usadas em estudos de dispersão de espécies e na análise de filogenia e sua difusão ocorreu a partir do desenvolvimento de métodos eficientes de visualização do produto enzimático (Ferreira e Gratapaglia, 1998). As isoenzimas foram utilizadas em estudos com abelhas inclusive com T. angustula (Castanheira e Contel (1995 e 2005). Em 1968 foram descobertas as enzimas de restrição houve um desenvolvimento da técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Esta técnica oferecia vantagens em relação à anterior e podia ser utilizada em estudos populacionais. Atualmente existem vários tipos descritos de marcadores moleculares que podem ser utilizados em estudos populacionais comportamentais e filogenéticos. O marcador é escolhido de acordo com o problema a ser analisado e com a disponibilidade de recursos (Avise, 1989). Os marcadores co-dominantes são mais indicados para estudos populacionais, pois, nesses casos, oferece maior precisão e vantagens técnicas do que os marcadores dominantes (Sunnucks, 2000; Arias et al., 2006). Entre as características que tornam os marcadores co-dominantes mais versáteis e precisos, destacam-se: i) grande abundância e distribuição uniforme por todo o genoma; ii) são multi-alélicos e, portanto, maior conteúdo informativo por loco (Ferreira e Gratapaglia, 1998). Os microssatélites são marcadores moleculares, que permitem acessar uma ampla gama de diferenciações e abordar os processos ecológicos e evolutivos subjacentes, sendo por isso adequados para estudos populacionais (Arias et at., 2006). 3.1 Microssatélites Os marcadores microssatélites também são denominados SSRs (Simple Sequence Repeats) ou STRs (Short Tandem Repeats). Inicialmente, o termo microssatélite foi utilizado apenas para designar repetições CA (ou CG) (Brito 2005 apud Litt; Luty, 1989) e os termos “Simple Sequence Repeats” ou “Short Tandem Reapeats” eram utilizados para as outras repetições. Atualmente o termo microssatélite é utilizado para quaisquer repetições que envolvam um pequeno número de pares de bases (Oliveira et al., 2006). Assim, os microssatélites constituem uma curta seqüência repetida em tandem (em “fila”), com um tamanho de 1-6 nucleotídeos, distribuídos aleatoriamente pelo genoma da maioria dos organismos. Essas seqüências podem se repetir por até algumas dezenas de vezes e, freqüentemente, exibem polimorfismo multi-alélico (Ferreira e Gratapaglia 1998). Para visualizar o polimorfismo nos microssatélites é realizada a amplificação das sequências repetidas pela reação em cadeia da polimerase (PCR), que utiliza pequenas seqüências de nucleotídeos como primers (Farah, 2000). Para isso, é mais indicado a seleção de primers específicos ou a transferência de primers heterólogos previamente testados (Francisco et al. 2006). 20 Os microssatélites podem ser separados em quatro classes: (i) perfeito, quando as seqüências são repetidas sem interrupção (GTGTGTGTGT); (ii) imperfeito, quando uma ou outra repetição apresenta uma base que não pertence à repetição (GTGTCGTGT); (iii) interrompido, quando há a inserção de um pequeno número de pares de bases entre as seqüências repetidas (GTGTGTAAAGTGT); e (iv) composto: quando dois ou mais microssatélites estão justapostos (CACACAGTGTGT) (Oliveira et al., 2006). Estas interrupções do tipo “ii, iii e iv” parecem estabilizar os microssatélites, visto que se observa menor incidência de erros durante a replicação nesses casos (Weber, 1990). Os microssatélites têm sido extremamente úteis em estudos populacionais, principalmente no que se refere às análises de relações de parentesco, variações espaciais intra-específicas e filogeografia (Sunnucks, 2000; Moritriz e Hills, 1996; Avise, 1989). A transferência de primers heterólogos de microssatélites é uma alternativa para a redução de tempo e de custos de seleção de primers específicos. Esta transferência se torna possível pela conservação de regiões que flanqueiam os microssatélites em espécies taxonomicamente próximas (Ferreira e Grattapaglia, 1998), mas há riscos de insucesso, sobretudo na detecção de alelos polimórficos. Atualmente há um grande número de estudos com microssatélites, incluindo vários com abelhas Meliponini (Chung et al., 1993; Butcher et al., 2001; Paxton et al., 2003; Peters, 2003; Jean-Chistophe et al., 2005; Francisco et al., 2006; Carvalho-Zilse e Kerr, 2006; Steiner et al., 2006; Thorén et al., 2007; Souza et al., 2007). Em muitos casos a transferência de primers entre espécies gerou resultados satisfatórios. Chung et al.(1993) transferiu com sucesso primers de bovinos para caprinos; Francisco et al. (2006) ressaltou que a transferência de primers heterólogos para Plebeia remota foi eficiente, apesar de revelar poucos alelos por loco; Carvalho-Zilse e Kerr (2006) utilizaram primers heterólogos entre espécies do gênero Melipona e o resultado foi satisfatório. 3.2 Estudos Populacionais Envolvendo Microssatélites Recentemente, a utilização dos microssatélites como marcadores moleculares em estudos populacionais e evolutivos tem sido bem sucedida em diversos organismos (Simonsen et al., 1998, Haavi et al., 2000, Clémencet et al., 2005). Arias et al. (2006) descreveram vários exemplos em que microssatélites e DNA mitocondrial (DNAmt) foram aplicados ao estudo de espécies de abelhas sociais. Os resultados obtidos já permitem formular hipóteses a cerca da filogenia, dinâmica populacional e evolução dos grupos de abelhas. Widmer et al. (1998) puderam constatar que populações de abelhas Bombus (Bombini) das ilhas Canárias (Bombus canariensis) e Madeira (Bombus maderensis) apresentavam grandes diferenças de afinidade com populações do continente próximo (Bombus terrestres), usando microssatélites e um loco do DNA mitocondrial do citocromo b. Com uso de microsatélites. Widmer e Schmid-Hempel (1999) detectaram diferenças consistentes entre 16 populações de Bombus pascuorum, que sustentavam o argumento de isolamento por processo de vicariância, causado pelo soerguimento dos Alpes. Em Meliponini, Francisco (2002) fez análises de DNAmt e microssatélites em Plebeia remota para estudos populacionais. O trabalho identificou diferenças genéticas entre amostras de populações de diferentes estados brasileiros (São Paulo, Paraná e Santa Catarina). Entretanto, mostrou que houve um baixo polimorfirmo na transferência de primers entre espécies. Werneck (2008) avaliou a influência de alelos nulos no sucesso sobre a transferência de sete primers para Melipona mandacaia, desenvolvidos para Melipona bicolor. Em estudos de populações de Partamona mulata e Partamona helleri (Meliponini), Brito (2005) observou baixa variabilidade genética nos locos de microssatélites de ambas as espécies e discreta estruturação genética dentro das populações locais. Segundo a autora, este último aspecto poderia ser conseqüência da fragmentação dos habitats de floresta ou de cerrados, áreas de distribuição das espécies. Em síntese, os microssatélites são muito úteis no estudo de diferenciações nas populações em grande escala ou escala geográfica e, provavelmente, também podem ser aplicados com sucesso na análise de estrutura de populações em menor escala espacial (populações locais ou em mosaico). No entanto, nos estudos com abelhas Meliponini tem sido observado baixo polimorfismo com a utilização de primers heterólogos, o que pode demandar maior esforço de caracterização de marcadores específicos em número adequado para análises robustas de estrutura espacial de populações.