Deleção direcionada de centrina em Leishmania Braziliensis utilizando CRISPR-Cas9: geração de uma linhagem atenuada para imunoprofilaxia - Rangel, Francys Andreina Avendano (2023)
As Leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas e não exitem vacinas para uso humano. Na América Latina, a Leishmania braziliensis é o principal agente causador da leishmaniose tegumentar. Aqui, visando o desenvolvimento de uma cepa atenuada de L. braziliensis com fins de imunoprofilaxia, nós empregamos a tecnologia CRISPR/Cas9 com sucesso. Geramos uma linhagem de parasitas transgênicos expressando Cas9 e T7 RNA polimerase, a qual foi empregada para a deleção direcionada de centrina, uma proteína do citoesqueleto envolvida na duplicação do centrossoma em eucariotos. O sequenciamento do genoma completo de L. braziliensis deficiente em centrina (LbCen-/-) não indicou a presença de mutações fora do alvo. In vitro, as taxas de crescimento de promastigotas de LbCen-/- e de tipo selvagem foram semelhantes, mas os amastigotas axênicos e intracelulares de LbCen-/- mostraram um fenótipo multinucleado, com sobrevivência diminuída em macrófagos infectados. Após a inoculação experimental em camundongos BALB/c, a LbCen-/- não induziu o desenvolvimento de lesões e os parasitas foram eliminados rapidamente. Porém, a imunização com LbCen-/- não conferiu proteção contra um desafio subsequente, diferentemente de outras linhagens com esta mesma deficiência. A resposta imune induzida pela inoculação com LbCen-/- foi caracterizada por níveis significativamente mais elevados de IL-4 e IL-10, não observados em camundongos leishmanizados com LbWT. Portanto, a imunização com LbCen-/- não é capaz de induzir uma resposta imune do tipo Th1, tornando os camundongos suscetíveis a desafios e a LbCen-/- não pode reproduzir a imunidade observada na leishmanização. Em conclusão, a deficiência da centrina em L. braziliensis causa atenuação do parasita, interrompe a capacidade de causar doença, mas não é capaz de estimular uma resposta imune protetora.