Proteases de leveduras para aplicação médica - Siqueira, Alessandra Alves Drumond (2004)
As proteases são enzimas que ocupam uma posição central com respeito à aplicação na área médico e industrial. Entre os vários tipos de proteases, utilizadas na indústria farmacêutica e de cosméticos, destacam-se as colagenases utilizadas para amaciamento da pele, higiene oral, na limpeza de feridas purulentas, em processos de cicatrização, queimaduras e como agente anti-trombolítico. Realizou-se este estudo com o objetivo de selecionar leveduras produtoras de proteases, avaliar as melhores condições de crescimento da espécie produtora de protease, caracterizar parcialmente a enzima quanto o pH e temperatura na estabilidade e verificar o efeito desta enzima na degradação do colágeno. Foram analisadas 50 amostras de leveduras isoladas de diferentes substratos, provenientes da coleção de cultura DPUA. As amostras foram cultivadas em extrato de Malte suplementado com gelatina 1,0 % a 30 ºC, sob agitação (140 rpm) por 72 horas. A atividade proteolítica qualitativa foi determinada em meio sólido ágar gelatina-leite e a quantitativa utilizando como substrato azocaseína 1 % p/v. Foram estabelecidas, para a espécie selecionada, as melhores condições de cultivo para produção da protease, foram estudados: características de patogenicidade, tamanho e idade do inóculo, temperatura ótima de crescimento, fontes de carbono e nitrogênio. Foram avaliadas as melhores condições de estabilidade da protease pH (6-12) e temperatura (25 º, 37 º, 40 º, 50 º, 60 º, 70 º e 80 ºC) e também, o efeito da enzima na degradação do colágeno. A determinação da atividade colagenolítica foi realizada em meio sólido utilizando colágeno solúvel como única fonte de carbono. Selecionou-se, entre as espécies identificadas, Trichosporon pullulans (DPUA), por apresentar o maior valor de atividade proteolítica em ensaio qualitativo (halo = 27 mm) e em ensaio quantitativo (420 U/mL). Os experimentos realizados para detectar as características de patogenicidade desta espécie demonstraram crescimento positivo a 37 ºC, atividade ureásica positiva e não foi detectada atividade fosfolipásica; a maior atividade proteolítica (246,66 U/mL) foi detectada com inóculo que correspondeu a 10 % do volume de meio e cultura estoque de 24 horas de crescimento. Os ensaios realizados para verificar o efeito da temperatura no crescimento e na produção da protease demonstraram que a maior biomassa (3,46 mg/mL) e atividade proteolítica (513,33 U/mL) foram obtidas a 30 ºC. A melhor fonte de carbono foi sacarose 1,0 % produzindo maior crescimento (6,18 mg/mL) e maior atividade proteásica (580 U/mL) e como fonte de nitrogênio destacou-se a peptona 0,5 % expressando os maiores valores de atividade proteolítica (755,55 U/mL) e biomassa de 7,55 mg/mL. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que a protease produzida por T. pullulans classifica-se como protease alcalina (pH ótimo 8,0). E maior estabilidade térmica da protease foi observada a 37 ºC onde a enzima manteve 100 % de sua atividade durante 40 minutos de incubação. T. pullulans degradou o colágeno produzindo halo de 28 mm. Esse estudo demonstrou que a protease apresenta atividade colagenolítica e poderá ser utilizada como agente terapêutico