Identificação molecular e produção de enzimas celulolíticas por Trichoderma spp - Melo, Laryssa da Silva (2009)
Trichoderma são fungos anamórficos pertencentes à classe dos hifomicetos, também chamados fungos imperfeitos, assexuais ou conidiais e que têm como teleomorfo o gênero Hypocrea. São fungos de vida livre, distribuídos em todo o mundo e encontrados em solos de diversas temperaturas, especialmente naqueles que contém matéria orgânica. Geralmente não são considerados importantes patógenos humanos, mas existem alguns relatos indicando patogenicidade ocasional em algumas espécies. Sua fácil manipulação e cultivo in vitro, estabilidade e viabilidade das colônias preservadas, fazem desse gênero um grande alvo para as pesquisas biotecnológicas. Por tais características, foram isolados Trichoderma das plantas Victoria amazonica, Rollinia sp., Murraya paniculata e Strychnos cogens; da madeira Scleronema micranthum, conhecida como cardeiro; de jatobá (Hymenaea courbaril), do solo de cultura de cubiu (Solanum sessiliflorum) e de terra preta de índio, com o objetivo de identificar, pela biologia molecular, em nível de espécie, tais isolados, bem como avaliar sua capacidade de produção de enzimas celulolíticas. Das 30 linhagens obtidas foram realizadas culturas monospóricas, as quais foram preservadas em óleo mineral, método Castellani e em glicerol 10%. A partir da suspensão em glicerol, de cada amostra foi inoculado 10μL em 20mL de BD e cultivado a 26oC, a 100 rpm por 40:00h. Em seguida foi extraído o DNA genômico, deste realizada a PCR específica para as regiões ITS-1 e ITS-2 do DNA ribossômico e posteriormente o sequenciamento. Para a produção de enzimas, os isolados foram previamente cultivados em meio indutor. Foram inoculados 10μL da solução de esporos (Glicerol 10%) em 50mL de solução de Manachini onde o substrato indutor utilizado foi a carboximetilcelulose. Os fungos foram incubados a 27°C, 120 rpm durante 120 horas. A dosagem de CMCase foi efetuada com base no método do Ácido Dinitrosalicílico. Para a dosagem de β-glucosidase foi utilizado o pnitrofenil- β-D-Glucopiranosídeo (pNPG) como substrato para a enzima. A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método de Bradford, utilizando-se o reagente concentrado comercial da Bio-RadTM e albumina de soro bovino (ASB), como padrão. O resultado da identificação molecular das primeiras 13 amostras nos revelaram as espécies: T. harzianum, T. koningii, T. asperellum, T. viride, T. ovaslisporum, T. hamatum, T. piluliferum e T. koningiopsis, com um percentual entre 96 e 99% de identidade e 100% de confiabilidade. Os resultados enzimáticos para CMCase indicaram valores baixos, inferiores a 0,100 U/mL com exceção de T. koningii (MPCe 10 3.2), T. harzianum (MPCe 2 2.2a), ambos isolados de M. paniculata, e o isolado 1437 identificado como Trichoderma sp., proveniente de terra preta de índio, que apresentaram valores um pouco mais altos de 0,112 e 0,103 e 0,105 U/mL, respectivamente. Para β-glucosidase, os resultados apresentados mostraram alta atividade na grande maioria dos isolados com destaque para T. harzianum MPCe 3 3.1(10,45U/mL) e T. piluliferum Vrc 2 3.2 (9,71 U/mL). Todos os isolados produziram proteínas em meio de cultura contendo carboximetilcelulose como substrato indutor