Análises moleculares de linhagens de Bacillus e Brevibacillus spp., isolados da Amazônia brasileira, ativas contra Aedes aegypti, Linnaeus, 1762 - Katak, Ricardo de Melo (2020)
O mosquito Aedes aegypti é considerado o vetor primário de muitos arbovírus causadores de doenças como a dengue, chikungunya e zika. Os problemas ocasionados por este vetor são imensuráveis, sendo necessárias novas estratégias de controle para amenizar os impactos na saúde pública. As bactérias do gênero Bacillus e Brevibacillus, constituem-se como principais microrganismos entomopatogênicos utilizados no controle destes mosquitos. Considerando a diversidade metabólica e genética destas bactérias, o presente estudo, objetivou avaliar o potencial químico e biológico das bactérias do gênero Bacillus e Brevibacillus, isolados de diferentes ambientes amazônicos, com toxicidade para as larvas de A. aegypti. Foram isoladas 143 linhagens de bacilos nos meios de cultivo (NA, LB e ISP2) por meio do choque térmico, no qual foi caracterizado por coloração de Gram, sendo encontrados 136 bacilos gram positivos e sete gram negativos. Por meio dos clusters do perfil fenotípico foram selecionadas 77 linhagens como representantes e identificadas pela sequência do gene 16S rRNA, sendo encontrado seis gêneros bacterianos como, Bacillus, Brevibacillus, Achromobacter, Serratia, Klebsiella e Brevundimonas. As 77 linhagens caracterizadas foram testadas em bioensaios seletivos contras larvas de A. aegypti, das quais 21 (27.2%) apresentaram atividade larvicida. As linhagens que apresentaram toxicidade acima de 50% foram utilizadas para os bioensaios das frações do sobrenadante e do pellet das culturas bacterianas por meio de bioensaios seletivos e quantitativos. Em relação aos valores da CL50 e CL90 das linhagens ativas (SPa07NA-Br. halotolerans e SX15LB-B. safensis) na fração do sobrenadante (SUP), não foi observado diferença estatística significativa (p>0.05) quando comparadas com a cepa padrão Bti BR101NA, nos intervalos de 24, 48 e 72 horas. Os resultados do pellet não autoclavado (PEL) em 48h mostraram que a linhagem SBC13LB-B. thuringiensis obteve valor de CL50 (0.004 mg/l) menor que o da cepa padrão Bti BR101NA (0.008 mg/l), sendo verificado diferença estatística significativa (p = 0.05), mostrando maior toxicidade. Considerando os resultados do pellet autoclavado + sobrenadante (APEL+SUP), as linhagens SP06LB-B. thuringiensis e SPa22LB-B. safensis não apresentaram diferenças estatísticas significativa (p>0.05) quando comparado com a cepa padrão Bti BR101NA nos intervalos de 24, 48 e 72h. Os resultados do pellet autoclavado (APEL), mostraram que a linhagem SPa22LB-B. safensis não apresentou diferença estatística significativa entre os valores de CL50 e CL90 nos intervalos de 24, 48 e 72h. As linhagens ativas nas frações do sobrenadante (SUP) e do pellet (PEL) foram utilizadas para o estudo de metabólitos secundários, no qual duas linhagens (SPa07NA-Br. halotolerans e SX15LB-B. safensis) apresentaram toxicidade nos extratos obtido do sobrenadante (SUP). A linhagem SPa07NA apresentou maior toxicidade na CL50 e CL90 sendo verificado diferença estatística significativa (p<0.05) nos intervalos de 24, 48 e 72h. O estudo dos metabólitos da linhagem SPa07NA-Br. halotolerans, permitiu o rastrear os metabólitos ativos nos extratos. Os resultados obtidos pela inserção direta em espectrometria de massas por ionização em electrospray mostraram que durante os 10 dias de cultivo das linhagens não foram observadas mudanças nos íons, mas sim a prevalência de íons majoritários. Além disso, a atividade biológica contra as larvas de A. aegypti não apresentaram diferenças significativas. A técnica de padronização de isolamento por HPLC semipreparativo aliados com os ensaios biológicos e fracionamento permitiram obter três frações e 12 subfrações ativas para as larvas. O perfil químico dos extratos de metabólitos das linhagens promissoras necessita de estudos complementares que podem ser realizados em trabalhos futuros a fim de caracterizar e elucidar as moléculas ativas. Além dos estudos dos metabólitos, foi avaliado o comportamento antagônico de duas cepas ativas que apresentaram atividade larvicida somente no pellet (PEL). Os estudos do potencial das linhagens GD02.13NA-B. toyonensis e SBC13NA-B. thuringiensis mostraram resultados semelhantes a cepa padrão Bti BR 101, no qual foi evidenciado colonização bacteriana nas partes da cabeça e tronco das larvas, e amplificação positiva para os genes Cry4 e Chi com potencial para produção de enzimas quitinases. Dessa forma, considera-se que as linhagens isoladas apresentam potencial para produção de metabólitos primários e secundários para diversas estratégias de controle para esses mosquitos.