Seleção de leveduras amazônicas capazes de metabolizar hidrolisado hemicelulósico e fermentar D-xilose - Matos, Ítalo Thiago Silveira Rocha (2010)
Foram isoladas leveduras a partir de diferentes habitats amazônicos, a saber, intestino de besouros da família Carabidae, conteúdo abdominal de cupins (Nasutitermes sp.), amostras de solos coletados em áreas de savanas (formação geomorfológica Boa Vista RR) e em matas de terra firme (Manaus AM). As leveduras foram isoladas segundo a capacidade de crescer invitro usando hidrolisado hemicelulósico de cana-de-açúcar (HACA) como fonte única de carbono, sendo selecionadas aquelas que fossem capazes de assimilar e fermentar D-xilose. Para tanto se utilizou meio de cultura composto por hidrolisado hemicelulósico de cana-de-açúcar (concentração de açúcar redutor total ajustada para 1%), suplementado por Yeast Nitrogen Base (YNB 6,7 g/L) e Agar (20 g/L). A capacidade de assimilar D-xilose foi atestada pela técnica replica-plating, descrita por Barnett et al. (1990), cultivando as colônias isoladas em placas de Petri contendo D-xilose (50 mM), YNB (6,7 g/L) e Agar (20 g/L). A capacidade fermentativa foi testada em tubos de ensaio contendo meio YUKX líquido, composto por extrato de leveduras (1,5 g/L), uréia (1,25 g/L), KH2PO4 (1,1 g/L) e D-xilose (50 g/L). Em cada tubo de ensaio foi adicionado um tubo de Durham para retenção de gás liberado pela fermentação. Outro teste qualitativo de fermentação foi efetuado, cultivando as leveduras em tubos Falcon® de 50 mL contendo 10 mL de YUKX. Os tubos foram vedados com rolhas de borracha contendo um orifício fechado por uma mangueira. Após sete dias de cultivo, a mangueira foi aberta dentro de uma coluna de água, para evidenciar o desprendimento de gás pela atividade fermentativa. Foram isoladas ao todo 76 colônias de leveduras, sendo duas associadas a solos de savana, oito associadas a solos de florestas de terra firme, 12 associadas a besouros da familia Carabidae e 54 associadas à Nasutitermes sp. Dentre estas, 28 foram capazes de assimilar D-xilose e três capazes de fermentar o referido açúcar, sendo duas associadas à Carabidae e uma a Nasutitermes sp. Estes resultados concordam com o que foi escrito anteriormente por Breznak (1982) e Blackwell (2004), os quais consideram que o trato digestivo de insetos xilófagos é uma rica fonte de microrganismos de interesse biotecnológico. As três linhagens de leveduras, fermentadoras de D-xilose (LC27, IB04 e IB09) foram cultivadas em YUKX e em HACA, a fim de caracterizá-las quanto ao crescimento celular (mensurando a densidade ótica / λ = 600 nm) e o consumo de açúcar redutor (quantificado pelo método DNS). O ensaio em fermentômetro foi executado para avaliação da perda de massa por desprendimento de CO2 a fim de se estimar a produtividade de etanol. Avaliou-se ainda a termotolerância (choque térmico a 52 ºC por 9 minutos) e tolerância ao etanol (cultivo estacionário por 7 dias em YPD + 20% etanol). Todos os experimentos foram feitos em duplicata, com pH inicial 5,5 e temperatura a 35 ºC. O consumo de açúcar redutor total em HACA foi em média de 78,3%, enquanto que em YUKX o consumo médio foi de 55,9%. Quando cultivadas em HACA, as linhagens demonstraram ainda potencial de sacarificação, elevando a concentração de ART em até 48% durante as primeiras 8 horas de cultivo. As linhagens IB04 e IB09 são termotolerantes, apresentando viabilidade celular superior a 85%, enquanto que LC27 esses valores foram inferiores a 40%. O teste de tolerância ao etanol demonstrou resistência pelas três linhagens, com média de 81 unidades formadoras de colônia nas primeiras 24 horas, tornando-se incontáveis a partir das 48 horas. A evolução de CO2 (valor médio de 3,2 g/L) permite estimar produção de etanol, mas com baixo rendimento, com estimativa de 3,34g/L. Todas apresentam potencial para utilização em processos biotecnológicos usando hidrolisado hemicelulósico como substrato.