Expressão e caracterização de trealose-6-fosfato fosfatase de Anopheles gambiae produzida em Pichia pastoris - Pessoa, Marcos Cézar Fernandes (2014)
A malária humana por ser uma doença tropical e parasitária de relevância médica, social e econômica, representa um dos mais importantes problemas de saúde pública no mundo. Em vista à resistência do inseto-vetor aos inseticidas, a pesquisa de novas ferramentas para o controle do vetor tem sido proposta. Uma das alternativas mais fascinantes baseia-se no uso de inibidores de enzimas que desempenham papel importante e fundamental no metabolismo e fisiologia do inseto. Uma destas enzimas é a trealose-6-fosfato fosfatase atuante na rota metabólica da trealose que desfosforila a molécula de trealose-6-fosfato, formando como produtos o dissacarídeo trealose e fosfato inorgânico. A trealose é um dímero de glicose encontrado em plantas, insetos e micro-organismos. Nestes organismos acredita-se ser importante para diversos papéis, um dos quais é servir como sítio de armazenamento de glicose para energia e/ou para a síntese de componentes celulares, outro papel é proteger as células contra pressões ambientais, tais como dessecação e congelamento, e para estabilização de proteínas contra a desnaturação. Por esse motivo, este trabalho teve como objetivo clonar e expressar o gene da trealose-6-fosfato fosfatase (TPP) de Anopheles gambiae na levedura metilotrófica Pichia pastoris e analisar a enzima recombinante expressa na levedura. De acordo com os resultados obtidos, foi possível demonstrar que a enzima TPP de A. gambiae foi expressa eficazmente na levedura P. pastoris e secretada no sobrenadante da cultura celular, conforme análise por Western blotting. Pelo perfil eletroforético em gel SDS-PAGE, após procedimento de purificação, foi revelado que a enzima TPP recombinante do clone TPP 61 tem massa molecular de ~36 kDa. A caracterização da enzima apresentou pH ótimo de 8,0 e temperatura ótima de 38 ºC. As constantes cinéticas da enzima indicaram um KM de 3,19 ± 0,10 mM e Vmáx de 290,0 ± 3,78 μmol.min-1. A análise de variância (ANOVA) com dois fatores revelou inibição significativa da TPP recombinante para EDTA (p <0,0001), NaF (p <0,0001), CaCl2 (p <0,001) e Ca(NO3)2 (p <0,0001) na concentração de 25 mM, enquanto que na concentração de 5 mM os compostos CaCl2 (p <0,001) e Ca(NO3)2 (p <0,05) foram significativos na inibição da enzima.