Desenvolvimento de um veto bifuncional para a bactéria endofítica Enterobacter agglomerans e Escherichia coli. - Nascimento, Alessandra Karisa Costa Lima do (2006)
Microrganismos endofíticos podem ser utilizados de diversas formas em biotecnologia. Dentre estas, se destaca o uso como carreadores de genes heterólogos para o interior de plantas possibilitando o desenvolvimento de novos processos biotecnológicos, o que torna relevante o desenvolvimento de vetores a partir de plasmídeos nativos das próprias bactérias endofíticas para transformação genética desse tipo de bactérias. Estudos envolvendo a Enterobacter agglomerans, uma bactéria endofítica isolada de Copaifera multijuga (copaíba) demonstraram a presença de um pequeno plasmídeo críptico denominado pEA1. Com base neste plasmídeo foram desenvolvidos os plasmídeos pEA1.0 e pEA2.4. O pEA1.0 foi construído a partir do fragmento de PstI (1000 pb) clonado em pUC18. O plasmídeo pEA2.4 foi desenvolvido a partir de um fragmento amplificado (2415 pb) clonado no vetor pCR2.1TOPO (INVITROGEN), o qual por primer walking permitiu a determinação da seqüência completa do plasmídeo original (2545 pb), que foi depositada no GenBank (acesso DQ659147). A análise da seqüência mostrou um índice GC de 34% e AT de 66%, e o mapa de restrição foi determinado utilizando a ferramenta NEBCutter2.0. Comparando a seqüência do pEA1 com o banco de dados, observou-se alta similaridade (62%) com a seqüência do plasmídeo pIGMS31 (2520 pb) de Klebsiella pneumoniae. Utilizando as ferramentas BlastX e ORF finder, o resultado demonstrou a presença de duas ORFs, sendo uma delas similar (E value = -98) à ORF2 do plasmídeo pIGMS31 (AY543072.1) isolado de K. pneumoniae. O plasmídeo pEA2.4 foi utilizado para transformar geneticamente bactérias Escherichia coli e E. agglomerans pelo método Tris-Cálcio/choque térmico. O pEA2.4 além de ser capaz de transformar geneticamente células de E. coli, mostrou-se também capaz de transformar geneticamente a E. agglomerans tornando-a resistente a canamicina, evidenciando seu caráter bifuncional. A eficiência de transformação da E. agglomerans com pEA2.4 extraído de E. coli foi de 5 x 104 T/μg, enquanto que a transformação desta bactéria com o pEA2.4 extraído da própria E. agglomerans, apresentou eficiência 1 ordem de grandeza maior (5,1 x 105 T/μg) provavelmente por ter sido, desta forma, evitado o processo de restrição da hospedeira. O plasmídeo pEA2.4 será utilizado como base para o desenvolvimento de vetores de expressão de genes heterólogos em E. agglomerans.