Desenvolvimento de ensaios moleculares baseados no Sistema CRISPR/Cas13a para detecção de Plasmodium vivax - Mota, Daniele Sousa (2024)
malária é considerada um problema de saúde pública global em humanos ao longo de anos, devido a ser uma das principais doenças com maior impacto na morbidade e mortalidade em muitos países tropicais e subtropicais. Os métodos mais comumente usados para o diagnóstico da malária são o exame microscópico, testes de diagnóstico rápido e reação em cadeia da polimerase, ferramentas limitadas pelo conhecimento técnico envolvido, menor sensibilidade e elevado custo de reagentes e equipamentos. Diante disso, há necessidade de desenvolver ferramentas que facilitem o diagnóstico de malária, em específico a espécie Plasmodium. vivax, de forma mais rápida e de simples execução em postos de atendimento (POC) por agentes de saúde. Os biossensores eletroquímicos inserem- se no cenário clínico como promissoras alternativas analíticas para o diagnóstico em POC. Desta forma, os objetivos centrais deste estudo foram o desenvolvimento de um biossensor eletroquímico baseado no sistema CRISPR/Cas13a, empregando eletrodos impressos de carbono modificados com estreptavidina (SPCE/STV), além da detecção de amostras clínicas de P. vivax por meio do ensaio de fluorescência baseado no sistema CRISPR/Cas13a. A proteína Cas13a foi expressa e purificada e a sequência de crRNA foi projetada para reconhecer um fragmento do gene pvmdr-1. Para o desenvolvimento do biossensor eletroquímico, foi projetado um oligonucleotídeo sintético ssDNA/ssRNA com presença de uma biotina, o qual foi imobilizado na superfície dos SPCE/STV para a posterior deteção molecular. As medidas eletroquímicas foram conduzidas por voltametria de pulso diferencial e voltametria cíclica. Como resultado, o teste CRISPR/Cas13a por fluorescência apresentou um bom desempenho em ambiente clínico. Das 30 amostras positivas, 27 apresentaram resultados positivo com o método, demonstrando uma sensibilidade clínica considerável. Das 20 amostras negativas analisadas, o método não detectou a presença de 19 delas, demonstrando uma especificidade aceitável. Além disso, o teste forneceu um limite de detecção de 1,35 pM, apresentando alta sensibilidade. Por sua vez, o biossensor desenvolvido usando o sistema CRISPR/Cas13a mostrou ser específico para o fragmento alvo, sendo registradas mudanças na resposta eletroquímica (aumento de corrente) após a clivagem colateral de Cas13a sobre o oligonucleotídeo imobilizado na superfície do eletrodo. Por outro lado, na ausência do alvo, o perfil voltamétrico não obteve alteração, indicando diferenças entre as amostras positivas e negativas. Como resultados promissores apresentados neste trabalho, os testes moleculares baseados em CRISPR/Cas13a podem fornecer uma abordagem alternativa para identificar infecções por P. vivax de maneira fácil e oportuna.