Desenvolvimento de novos vetores bem regulados para Escherichia coli - Moreira, Diego da Silva (2023)
Neste trabalho foi construído um conjunto de vetores de expressão regulados para finalidades de clonagem e expressão de genes heterólogos em Escherichia coli. Os promotores são elementos essenciais dos cassetes de expressão utilizados nesse tipo vetores. Os vetores, derivados desse trabalho, que expressam genes heterólogos em diferentes níveis e de forma bem regulada foram baseados em um promotor sintético denominado de DM. A atividade do promotor DM pode ser modulada tanto por IPTG como por glicose. Os plasmídeos denominados: pDM02 (baixa cópia), pCDM (baixa cópia), pDMU01 (alta cópia) e pDMU02 (alta cópia) foram capazes de expressar em altos níveis e de maneira regulada em E. coli as sequências gênicas da GFP (Green Fluorescent Protein), da tiorredoxina humana fusionada com a enteroquinase bovina e do hormônio de crescimento de tambaqui. A sequência promotora DM foi modificada por meio de síntese química randômica de DNA para a construção de uma biblioteca de novos promotores sintéticos e estes foram a seguir ligados ao vetor pCDM em posição adequada para expressar o gene repórter da GFP. Clones de E. coli contendo plasmídeos recombinantes com diferentes promotores foram obtidos. Um grupo de clones que possuem novas sequências promotoras mantiveram a regulação por glicose e tiveram maiores níveis de expressão enquanto outro grupo de clones apresentou menor nível de regulação por glicose, porém com níveis bem maiores de expressão de GFP. Os resultados mostram que os novos promotores sintéticos podem ser utilizados para o desenvolvimento de novos, potentes e regulados vetores de expressão para a expressão de genes heterólogos tanto para fins de pesquisa como para bioindustriais.