Propriedades fenotípicas e moleculares associadas aos aspectos evolutivos de Enterococcus faecium: análise comparativa de estratégias de um patógeno oportunista - Silva, Beatriz Nascimento Monteiro da (2017)
Enterococcus faecium se destaca como uma espécie bacteriana frequentemente multirresistente aos antimicrobianos, associada à infecções hospitalares em todo o mundo. O objetivo deste estudo foi investigar comparativamente as características de duas amostras de E. faecium: SS-1274 (derivada da amostra tipo da espécie) e CL-6729 (amostra clínica proveniente de infecção urinária de origem hospitalar). Estas amostras foram caracterizadas quanto à susceptibilidade aos antimicrobianos, presença de determinantes genéticos de resistência e de virulência e métodos de tipagem molecular PFGE, MLVA e MLST. Foi também avaliada a capacidade de formação de biofilmes e as características associadas a sua arquitetura, por microscopia confocal a laser (CLSM). A resposta de macrófagos da linhagem J.774 às células planctônicas e aos biofilmes foi identificada por quantificação das citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-6 e IL-10 (através de ensaio imunoenzimático), dosagem de óxido nítrico e CLSM. Avaliações por ESI-Q-TOF foram empregadas para determinação do perfil proteômico de biofilmes e do crescimento planctônico, a partir de resultados prévios obtidos por SDS-PAGE. Foi também realizado o sequenciamento do genoma completo (WGS) da amostra clínica CL-6729 com auxílio da plataforma Illumina Hiseq e anotação dos genes pela PATRIC 3.2.75.Nossos resultados demonstraram que CL-6729 é multirresistente e alberga os genes vanAe esp; é pertencente ao MT-12 e ao ST-78, consequentemente faz parte do complexo clonal 17 (CC17). Esta amostra apresentou resistência constitutiva à vancomicina. Análises da integridade do Tn1546 revelaram a presença de IS19 inserida no gene vanS. Pela reunião de dados obtidos por qPCR e sequenciamento parcial dos genes envolvidos, a presença de IS19 parece estar influenciando direta ou indiretamente na alteração da expressão da resistência. A expressão constitutiva da resistência à vancomicina foi detectada tanto para o cultivo planctônico como em biofilmes. Biofilmes de E. faecium apresentaram biomassa rica em proteína após 24 h de incubação e em DNA após 72 h. Dados relativos à interação por 24 h de CL-6729 macrófagos J.774 demonstraram uma modulação negativa da produção de nitrito pelos macrófagos. Por outro lado, em relação ao estímulo à produção de citocinas, os dados sugerem uma indução na produção das citocinas, TNF-α, IFN-, IL-6 e IL-10, tanto por biofilmes quanto células planctônicas de ambas as amostras bacterianas. Além disso, CLSM revelou que macrófagos são capazes de penetrar na estrutura dos biofilmes. Os resultados relativos à espectrometria de massa sugerem que células de biofilmes de E. faeciumparecem estar ativas, diante da identificação de um considerável número de proteínas relacionadas ao metabolismo e divisão celular. Análises por WGS revelaram um tamanho de 2,9 Mb, com 3.125 genes preditos, dentre os quais cerca de 2.000 genes estão associados ao metabolismo de carboidratos e de ácidos núcleicos e à divisão celular. Foram anotados genes associados à resistência aos antimicrobianos, virulência, sequências de inserção, fagos e plasmídeos. Nossos dados apontam para um processo evolutivo dinâmico e especializado, que indica alterações significativas entre amostras de uma mesma espécie. Tais alterações demonstram capacitar esta espécie, anteriormente identificada como patógeno de baixo potencial de virulência, ao status de um microrganismo capaz de atingir gravemente a saúde humana. Consideramos que nossos resultados agregam informações que reafirmam a necessidade do acompanhamento contínuo das infecções causadas por microrganismos desta espécie, diante de suas habilidades de adaptação e persistência.