Caracterização das células-tronco mesenquimais de medula óssea humana de pacientes com osteoartrite purificadas por adesão diferencial - Claudino, Gustavo Paris (2019)
Células-tronco mesenquimais (CTM) de medula óssea apresentam grande potencial terapêutico devido a sua multipotencialidade e propriedades imunoreguladoras e anti-apoptóticas. Entretanto, a heterogeneidade marcante presente na população denominada como CTM, uma vez que são isoladas e identificadas por sua capacidade de adesão ao plástico, aliada à ausência de marcadores precisos para caracterizá-las, dificulta a purificação das células multipotentes. Como a célula mais indiferenciada resguarda maior potencial proliferativo e de diferenciação, o presente estudo propõe um protocolo de isolamento de CTM de medula óssea adesão-dependente, com cultivo do sobrenadante normalmente descartado após 3 dias, identificadas como CTM de adesão lenta (CTM-AL). Os resultados demonstraram que as CTM-AL apresentaram maiores colônias primárias, além de maior frequência e tamanho de colônias secundárias que a população de CTM isolada pelo método padrão-ouro, de adesão rápida (CTM-AR). Além disso, quando diferenciadas nas linhagens adipogênica e osteogênica, as CTM-AL demonstraram maior capacidade de diferenciação adipogênica que as CTM-AR, enquanto mantiveram a mesma capacidade de diferenciação osteogênica. Na caracterização por citometria, as células de ambas as populações apresentaram, majoritariamente, o fenótipo CD45-/CD31-/CD73+/CD90+/CD29+/CD44+. As CTM-AR apresentaram maior frequência de células CD45+, HLA+ e CD184+, enquanto as CTM-AL mostraram-se enriquecida em células CD24+, CD49d+ e CD146+. Além da frequência, a intensidade de fluorescência de células CD146+ também foi maior em CTM-AL. Ademais, -actina de músculo liso foi detectada nas células de ambas as populações. Como a presença de CD146 e -actina de músculo liso está fortemente correlacionada com a posição anatômica perivascular, aonde CTM indiferenciadas se localizam, seu papel na formação e desenvolvimento de vasos endoteliais foi avaliado. Células endoteliais da microvasculatura humana (HMEC)-GFP+ foram co-cultivadas em matrigel com CTM-AR ou CTM-AL PKH26red+ (5:1), por 72 horas. Durante todo o experimento, observamos CTM-AR e CTM-AL adjacentes aos túbulos formados, de maneira abluminal. Em ambos os co-cultivos houve uma ação inibitória da formação de vasos durante 72 horas. Dessa forma, as CTM-AL referem-se à população com maior capacidade proliferativa, menor grau de contaminação celular (CD45+/HLA+) e enriquecida em células CD146+. Além disso, as CTM-AL são capazes de organizar e estabilizar rede tubular endotelial, mostrando perfil semelhante a pericito. Assim, utilizando o protocolo aqui proposto, purificamos uma população de CTM com perfil perivascular, mais indiferenciadas. Futuras investigações determinarão o potencial terapêutico e a identificação do fenótipo preciso das CTM multipotentes.