Efeito de microvesículas de melanoma na polarização de neutrófilos humanos - Bastos, Daniel Arthur Guimarães (2016)
Para entender os mecanismos envolvidos no crescimento tumoral é necessária a compreensão detalhada do seu microambiente, formado por diferentes componentes de matriz extracelular, fatores de crescimento, citocinas e diversos tipos celulares. Células do sistema immune presentes no microambiente têm suas funções pró-inflamatórias modificadas de forma a auxiliar o crescimento tumoral. Estudos recentes mostram evidências de dois fenótipos distintos de neutrófilos associados ao tumor (TAN): um pró-tumoral, TAN N2, ou um anti-tumoral, TAN N1. Evidências também apontam que este microambiente é rico em microvesículas (MV), produzidas abundantemente pelo tumor. A maior parte das MV não apenas transporta informações moleculares de suas células de origem, mas também são capazes de modular a atividade de células alvo. Embora já tenha sido demonstrado que MV provenientes de tumores são capazes de interagir com diferentes tipos celulares no microambiente, não há dados na literatura sobre a sua contribuição na modulação de TAN. O objetivo deste estudo foi investigar se MV produzidas por uma linhagem de melanoma humano modulam a atividade de neutrófilos (PMN), alterando seu fenótipo para um tipo-N2. As MV foram obtidas de meio condicionado da linhagem celular de melanoma humano MV3 e quantificadas através de microscopia em tempo real ZetaView® e marcação para anexina-V. PMN humanos, isolados por Gradiente de Percoll, foram incubados na presença ou ausência de MV (10% v/v) ou LPS (10 µg/mL) em diferentes tempos. A quimiotaxia foi realizada em uma Câmara de Boyden de 48 poços modificada. A apoptose foi avaliada por citometria de fluxo. A formação de armadilhas celulares neutrofílicas (NETs) foi avaliada pela quantificação de DNA e imunofluorescência. Os níveis de ROS intracellular, NO e peróxinitrito foram determinados através da oxidação das sondas CM-H2DCFDA, DAF-FM e HPF, respectivamente. A viabilidade de células MV3 co-cultivadas com PMN foi avaliada por ensaios de MTT. A expressão gênica de marcadores moleculares foi obtida por RT-PCR quantitativa. O conteúdo de CXCR4 e arginase foram obtidos por citometria de fluxo e Western blot, respectivamente. As MV induziram quimiotaxia de PMN, e este efeito foi inibido pela toxina pertussis e é dependente da ativação da via PI3K-AKT. Foi também observado que o efeito das MV na quimiotaxia de PMN depende da ativação de CXCR2, uma vez que seu inibidor, SB225002, anulou a migração de PMN. As MV retardaram a apoptose espontânea de PMN, estimularam a formação de NETs e induziram a produção de ROS intracelular. O tratamento com as MV diminuiu a produção basal de NO, e aumentou a expressão de CXCR4 e arginase, assim como o conteúdo de mRNA de vários marcadores moleculares de TAN N2, como arginase, CXCR4 e VEGF em PMN. Por ultimo, PMN tratados com MV não afetaram a viabilidade de células de melanoma em co-cultura. Esses dados indicam que MV derivadas do melanoma podem ter um importante papel na modulação do fenótipo dos TAN no microambiente tumoral em um fenótipo TAN N2, que apresenta expressão aumentada de marcadores moleculares pró-tumorais e baixa atividade citotóxica.