Análise celular e ultraestrutural dos mecanismos de patogênese de cepas de Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) invasoras em células intestinais in vitro e ex vivo - Braga, Ricardo Luís Lopes (2017)
A síndrome diarreica é considerada um grave problema de saúde pública em todo o mundo e é considerada uma das principais causas de morbidade e mortalidade nos países em desenvolvimento. A patogênese de Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) permanece incerta e tem sido investigada extensivamente pela utilização de modelos in vitro e, em menor grau, de modelos ex vivo. A competência de EAEC para aderir ao epitélio intestinal do hospedeiro é um papel fundamental para a colonização e o desenvolvimento da doença. Além disso, EAEC pode invadir células intestinais e causar alterações graves no epitélio intestinal. O presente estudo investigou a interação de cepas EAEC invasoras isoladas de diarreia infantil com mucosa ileal e colônica de coelho ex vivo. As cepas EAEC também foram avaliadas quanto à capacidade de persistência intracelular associada à produção de citocinas na linhagem intestinal T84. A viabilidade celular e ocorrência de apoptose/necrose na linhagem T84 também foi avaliada. Os ensaios de aderência foram realizados com as cepas co-incubadas com fragmentos de intestino de coelho durante um período de 6 horas e foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A persistência intracelular e a produção de citocinas por ELISA em “sanduíche” foram avaliadas em 24 horas e as microscopias por contraste de fase e de fluorescência e citometria de fluxo foram conduzidas após 6, 16 e 24 horas de interação com células T84 infectadas. Através da MEV, observamos que todas as cepas de EAEC aderiram a ambos os sítios intestinais (íleo e cólon) com o padrão de aderência agregativo típico de "tijolos empilhados", porém o maior grau de aderência foi observado na mucosa colônica. As taxas de sobrevivência de EAEC H92/3, I49/3 e 042 foram 1,4x103, 3,2x103 e 0,5x103 UFC/ mL, respectivamente. Todas as cepas EAEC testadas induziram quantidades significativas de IL-8, IL-6 e TNF-α em comparação com células T84 não infectadas. A microscopia de contraste de fase mostrou perda de viabilidade em células infectadas por períodos de 16 horas. Por microscopia de fluorescência, observamos que as células infectadas com EAEC H92/3 e I49/3 apresentaram danos nos núcleos. Além disso, por citometria de fluxo, nossos dados revelaram que EAEC provocou apoptose tardia e necrose de células T84. Esses dados mostraram que as cepas de EAEC invasoras podem ter um alto tropismo para o cólon humano. As cepas invasoras podem sobreviver dentro da linhagem celular intestinal, induzindo uma resposta imune proinflamatória e desencadeando processos apoptóticos e/ou necróticos em células T84. As diferentes vias de virulência investigadas no presente estudo contribuem para o entendimento do mecanismo de patogenicidade de EAEC invasoras.