Investigação do papel de APE1 em modelos de câncer de mama: em busca de novas funções moleculares - Rodrigues, Juliana Alves (2021)
O câncer de mama é a segunda neoplasia que mais mata mulheres em países desenvolvidos e a primeira causa de morte em países em desenvolvimento. A via de reparo por excisão de base (BER) é responsável por reparar os danos causados por radicais livres no DNA, entretanto, o mau funcionamento contribui para a formação e progressão de tumores. A endonuclease APE1, principal enzima de BER, é responsável por preparar os sítios abásicos para continuidade do reparo e a expressão aumentada tem sido relacionada com agressividade e um prognóstico ruim. Desta forma, neste trabalho foi avaliada a função da endonuclease APE1 na proliferação, agressividade, e regulação gênica de modelos celulares de câncer de mama. O ensaio de WST-1 foi realizado para avaliar a viabilidade das culturas celulares após inibição da APE1 com o CRT0044876. O ensaio de Anexina V/7-AAD foi realizado para investigar o mecanismo de morte ativado pelo CRT0044876. Em seguida, foi realizado o ensaio de imunofluorescência com faloidina para avaliação do citoesqueleto de actina. Ademais, foi realizado o ensaio de microarranjo a fim de investigar as possíveis alterações de expressão gênica causadas pela inibição de APE1 e a validação por PCR em tempo real da expressão de genes relacionados a regulação da via de citoesqueleto. Foram realizados os ensaios de migração celular por Wound-healing e invasão celular em Transwell® com matrigel, para investigar o potencial metastático dos modelos celulares. Por fim, a análise de TCGA foi utilizada para investigar possíveis correlações da assinatura gênica da atividade de APE1 e expressão de genes de vias alteradas do microarranjo. O ensaio de viabilidade celular mostrou que a inibição da função endonuclease da APE1 é importante para viabilidade de células MDA-MB-231 e MCF-7, reduzindo em aproximadamente 50 % a viabilidade em culturas de células MDA-MB-231 e em 25 % a viabilidade em culturas de células MCF-7 incubadas com CRT0044876 em concentrações maiores que 1000 µM, após 6 h de tratamento. O ensaio de apoptose/necrose mostrou que ambos os mecanismos são acionados simultaneamente em células MDA-MB-231, onde as taxas de apoptose e necrose foram de aproximadamente 57% e 59%, respectivamente. A imunofluorescência em células MDA-MB-231 mostrou formação de lamelipódios e fibras de estresse. O microarranjo mostrou alteração de 2399 genes regulados positivamente e 496 genes regulados negativamente em células MDA-MB-231, sendo que a principal via alterada foi a relacionada à regulação do citoesqueleto. Em adição, o ensaio de migração celular mostrou variação significativa, aproximadamente 10%, após tratamento com CRT0044876 em células MDA-MB-231. Por fim, através da PCR pôde-se observar aumento de aproximadamente 11 vezes nos transcritos de MMP1, aumentado 8,25 vezes no microarranjo, em células MDA-MB-231. Em células MCF-7 houve redução de aproximadamente 4 vezes nos transcritos de PAK2, que aparece no microarranjo aumentado 2,92 vezes. Análises do TCGA, indicaram que há uma correlação média entre atividade da APE1 e a expressão de MMP1. No subtipo basal-like há maior expressão de ENAH, NRAS, NCKAP1, DIAPH3 e MMP1. Desta forma, os resultados indicam que a inibição da função endonuclease da APE1 é importante para viabilidade em culturas de células MDA-MB-231 e MCF-7, porém só induz alteração morfológica em células MDA-MB-231. Tal inibição sugere ainda uma regulação gênica de APE1, principalmente em relação ao citoesqueleto e processo de migração de células MDA-MB-231