O microambiente de hipóxia reprime a transcrição de HIF1A que é revertida pelo tratamento com agente demetilante em linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231 - de Amorim, Ísis Salviano Soares (2016)
O microambiente tumoral de hipóxia é uma característica comum a tumores sólidos. O fator de transcrição HIF-1α, ativado em hipóxia, coordena a expressão de genes que tornam as células tumorais mais agressivas. Embora haja um acúmulo da proteína HIF-1α em hipóxia, os níveis de mRNA de HIF1A apresentam-se diminuídos. Até então, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos na regulação dos transcritos de HIF1A. Dentre os mecanismos conhecidos que, normalmente, associam-se a inibição da transcrição, a metilação do DNA poderia elucidar uma nova forma de controle, a nível transcricional, de HIF1A. Diante disso, o presente trabalho objetivou investigar o papel da metilação do DNA no controle transcricional de HIF1A, em hipóxia. Para verificar a possibilidade de HIF1A e, também de VEGFA, gene alvo de HIF-1α, serem regulados por metilação do DNA, foi realizada uma predição in silico de sítios de metilação, identificados por ilhas CpGs, no promotor e no primeiro éxon do gene de HIF1A e VEGFA, com auxílio do software Methprimer. A ação demetilante de 5-aza-dC foi confirmada pela amplificação, por PCR, de PGR, inibido por metilação, na linhagem de câncer de mama, MDA-MB-231, usada como modelo experimental. O ensaio de WST-1 foi usado para avaliar a toxicidade de 5-aza-dC. Foram avaliados os efeitos da 5-aza-dC sobre os níveis de mRNA de HIF1A e VEGFA, por RT-qPCR. Além disso, Alteração no nível proteico de HIF-1α, após 5-aza-dC, foi avaliada por citometria de fluxo. Em todos os ensaios, foi utilizada a dose de 100 μM 5-aza-dC, em normóxia (48h e 72h) e hipóxia. Em hipóxia, as células foram tratadas com 5-aza-dC por 72h, sendo as últimas 24h de incubação na câmara de hipóxia. A predição in silico identificou 6 ilhas CpGs na região avaliada de HIF1A e 3 ilhas CpGs, em VEGFA. A 5-aza-dC induziu a expressão de PGR, confirmando sua ação demetilante e, não reduziu consideravelmente a viabilidade celular. Em normóxia, 5-aza-dC elevou os níveis de mRNA de HIF1A 6,5 vezes (±3,8) (48h) e 2,0 vezes (±0,5) (72h) e, aumentou os níveis de VEGFA em 2,6 (±0,6) (48h) vezes e 2,4 vezes (±0,5) (72h). Em hipóxia, os níveis de mRNA de HIF1A diminuíram 10 (±6,9) vezes, enquanto que os níveis de VEGFA aumentaram 1,7 (±0,4) vezes. A 5-aza-dC reverteu o resultado obtido com a hipóxia, elevando os níveis de mRNA de HIF1A 7,5 (±2,7) vezes, no entanto diminuiu, em 1,6 (±0,09) vezes, os níveis de VEGFA. Além disso, o nível proteico de HIF-1α também aumentou após 5-aza-dC, em normóxia e hipóxia. Os dados sugerem que os promotores de HIF1A e VEGFA podem estar metilados em normóxia, em um percentual ainda desconhecido. Além disso, sugere-se que, em hipóxia, haja aumento do grau de metilação, capaz de inibir a transcrição de HIF1A. No entanto, em hipóxia, a metilação do DNA parece não contribuir diretamente com a regulação de VEGFA. Portanto, esse trabalho indica que a metilação do DNA pode ser uma nova forma de regulação de HIF-1α, a nível transcricional, sobretudo em hipóxia.