Papel da trombospondina-1 no contexto endotelial dos cavernomas cerebrais: estudos fenotípicos e funcionais - Nascimento, Caroline Barbosa Peres do (2023)
Muitos estudos vêm utilizando o modelo in vitro para investigar mecanismos celulares de doenças, como a malformação cavernosa cerebral (CCM) ou cavernomas cerebrais. Cavernomas estão associados à superativação da via de sinalização RhoA/ROCK em células endoteliais, levando ao excesso de fibras de estresse que promovem a abertura das junções aderentes interendoteliais, alterações em proteínas de junções, como zona ocludina-1 (ZO-1) e caderina endotelial vascular (VE-caderina), com consequente extravasamento de líquidos do sangue e formação de estruturas bolhosas que são denominadas “cavernas”. A doença decorre de mutações de perda de função de um dos genes CCM1(KRIT-1), CCM2 e CCM3/PDCD10, que regulam negativamente a via de RhoA/ROCK, além de também estar associada à uma expressão reduzida de TSP-1. A trombospondina-1 (TSP-1) é uma proteína matricelular que tem como característica a habilidade tanto de inibir quanto de estimular a angiogênese através de interações com seus múltiplos domínios funcionais, sendo envolvida em numerosas atividades biológicas. A fim de compreender o complexo papel das proteínas CCM e da TSP-1 neste contexto patológico, modelos experimentais de células miméticas do fenótipo cavernomatoso têm sido desenvolvidos, através do silenciamento de uma das isoformas de proteína CCM. Neste trabalho, optamos por padronizar o silenciamento da expressão da proteína CCM3. Células endoteliais microvasculares humana (HMEC-1) imortalizadas e células endoteliais primárias da veia umbilical humana (HUVECs) foram utilizadas nos ensaios. A expressão de CCM3 nessas células endoteliais foi confirmada por marcação imunofluorescente. As duas células endoteliais apresentaram diferentes susceptibilidades ao procedimento de eletroporação, que pôde ser optimizado para cada tipo celular. HUVECs e HMEC-1 apresentaram picos de silenciamento no tempo de 48 horas pós-transfecção e com concentração de siRNA (específico e “non-targeting”) de 300 nM. Com o objetivo de verificar se o silenciamento produziu os efeitos compatíveis com a aquisição do fenótipo cavernomatoso, ensaios funcionais foram realizados em células selvagens e silenciadas: análise da organização do citoesqueleto de actina; avaliação da proliferação das células endoteliais; análise do estado de fosforilação da cadeia leve de miosina (MLC) e análise da diferenciação tubulogênica. Nossos resultados mostraram que o silenciamento de CCM3 resultou em células que reproduzem algumas importantes características de células endoteliais cavernomatosas, como o aumento das fibras de estresse longitudinais, aumento da fosforilação de MLC. Além disso, foi observada uma redução da VE-caderina no pico de silenciamento (48 h), provavelmente relacionada ao aumento da reciclagem deste receptor de junções aderentes (AJs). Observamos uma redução da expressão de TSP-1, com concomitante aumento de fragmentos N-terminais, de natureza pró-angiogênica. Nossos resultados sugerem que a geração de fragmentos proteolíticos angiogênicos a partir da TSP-1, em oposição à forma intacta desta proteína, podem ser parte do mecanismo que leva à desestabilização de AJs em células endoteliais cavernomatosas.