Internalização e sobrevivência intracelular de Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) em enterócitos humanos cultivados in vitro - Prado, Esther Helena Rondon Barretto (2017)
Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) causam doença em humanos e animais. Além de doença diarreica, determinam complicações sistêmicas como síndrome hemolítica urêmica (SHU), púrpura trombótica trombocitopênica ou ainda sequelas como hipertensão arterial e isquemia miocárdica, entre outras. A ampla distribuição de STEC no trato gastrointestinal de uma variedade de animais, particularmente bovinos e outros ruminantes, indica o caráter zoonótico da doença. STEC, além de colonizarem bovinos, podem contaminar alimentos como a carne e o leite e sobreviver no solo, esterco, pastagens e na água, importantes veículos para a sua transmissão. A maioria das cepas STEC invadem enterócitos e podem persistir intracelularmente. Há evidências de que a localização intracelular de STEC constituiria uma estratégia eficiente para a colonização do animal hospedeiro. Alguns patógenos têm a capacidade de explorar as vias endocíticas da célula hospedeira para a sua internalização. Embora muito se saiba quanto aos conteúdos e as estruturas endocíticas, pouco se sabe sobre os mecanismos de endocitose específicos pelos quais estes conteúdos são recrutados e internalizados. No presente estudo foram investigados aspectos da invasão de células Caco-2 por cepas STEC representativas de alguns sorotipos envolvidos em doença humana, como EDL931 (O157:H7), 282/2 (O8:H19) e 784/1 (O113:H21). Foram empregados testes de inibição da invasão bacteriana por drogas que interferem em vias endocíticas (cloridrato de clorpromazina, metil-β-ciclodextrina e filipina ) e imunofluorescência para a detecção de proteínas marcadoras de endossomas precoces (Rab5, EEA-1) endossomas tardios (Rab7) e lisossomos (LAMP1), além da sonda LysoTracker Red DND-99. A clorpromazina foi eficiente na inibição da atividade invasora de todas as cepas STEC, caracterizando o envolvimento da via da clatrina na internalização de STEC, pelo mecanismo de zippering. Para algumas cepas (sorotipos O157:H7 e O113:H21) um segundo mecanismo, via lipid rafts/caveolina pareceu também participar. Todas as cepas mostraram colocalização com os marcadores EEA-1, Rab7 e LAMP1, mas não com Rab5. A colocalização com Rab 7, marcador de endossomas tardios só ocorreu 3 horas pós-infecção, sendo possível que este tempo contribua para retardar a fusão dos fagossomas aos lisossomos, favorecendo a sobrevivência e multiplicação inicial do microrganismo. Entre 1 e 3 horas pós-infecção, apenas parte dos fagossomos contendo STEC demonstrou marcação por LAMP1 e fusão com lisossomos, avaliada pelo uso da sonda LysoTracker Red DND-99. Nesta etapa da infecção foram encontradas numerosas bactérias íntegras em fagossomas não marcados com LAMP-1 ou com a sonda. Já em fase tardia da infecção (48 horas), ocorreu uma redução no número de bactérias intracelulares e apenas uma minoria destas não associada a lisossomos, conservando a sua integridade estrutural. Estes resultados sugerem que uma subpopulação das STEC intracelulares sobrevive e persiste, evitando de alguma forma a sua destruição pelos lisossomas. Tal característica pode ser relevante para a prolongada persistência de STEC no hospedeiro animal.