O complexo NADPH oxidase e espécies reativas de oxigênio favorecem a infecção de macrófagos por Trypanosoma cruzi - Paula, Jéssica Isis Oliveira de (2015)
O Trypanosoma cruzi é um parasito intracelular obrigatório capaz de proliferar no interior de macrófagos, os quais respondem ativando a enzima NADPH oxidase (Nox). Essa enzima gera ânion superóxido (O2 -), que pode ser dismutado em outra espécie reativa de oxigênio (ROS), o peróxido de hidrogênio (H2O2). No entanto, ainda não é compreendido como o parasito sobrevive e se desenvolve neste ambiente inóspito. Sendo assim, investigamos a relação entre a Nox e ROS durante a infecção de macrófagos por T. cruzi. Nesse intuído, foram utilizados os inibidores da Nox, difenileno iodônio, DPI (5 µM), e apocinina (10 µM), os antioxidantes, N-acetilcisteína, NAC (1 mM), e urato (1 mM), os pró oxidantes H2O2 (10, 30 ou 50 µM), menadiona (5 µM) e paraquat (20 ou 40 µM), e os inibidores de PKC, BIS (0,05 µM) e de PP2A, o ácido ocadáico, AO (0,1 µM). Primeiramente, avaliou-se a influência de Nox e ROS durante a infecção de macrófagos por T. cruzi. Para isso, os macrófagos foram incubados com DPI, apocinina, NAC, H2O2 ou menadiona e infectados com tripomastigotas na proporção de 10:1. Após 72 h, quantificou-se a infecção por contagem de amastigotas intracelulares. Observou-se que DPI, apocinina e NAC diminuíram a infecção, enquanto que o H2O2 levou um aumento da mesma. Menadiona reduziu a porcentagem de macrófagos infectados, mas não alterou a média de parasito por célula e nem o índice endocítico. A partir desses resultados, investigamos se Nox e ROS afetam as formas amastigotas intracelulares de T. cruzi. Para esta finalidade, os macrófagos foram previamente infectados por 3 h com tripomastigotas e incubados em DMEM + 10% de SFB overnight para a diferenciação em amastigotas. Após esse tempo, as células foram tratadas com DPI, apocinina, NAC, H2O2 e menadiona por 48 h, e em seguidas quantificou-se a infecção. Os parâmetros da infecção foram reduzidos somente por DPI. Entre os oxidantes, o H2O2 foi o único capaz de aumentar o número de amastigotas intracelulares. Além disso, avaliamos o efeito dos antioxidantes, NAC e urato, assim como de H2O2, menadiona e paraquat na amastigogênese in vitro. Curiosamente, o H2O2 foi único a influenciar a diferenciação in vitro, aumentando em 19% o percentual de amastigotas nas primeiras 2 h de incubação. Diferentemente, após 4 h de incubação menadiona reduziu 15% da diferenciação. A partir deste resultado, investigamos envolvimento de PKC e PP2A na amastigogênese in vitro induzida por H2O2. Para isso, foram utilizados o BIS, inibidor de PKC, e o AO, inibidor de PP2A. A presença de BIS não interferiu na amastigogênese. O AO sozinho não afetou a diferenciação, mas foi capaz de reverter o efeito do H2O2. Coletivamente, nossos resultados sugerem um novo papel para ROS e para ativação de Nox durante a infecção de macrófagos por T. cruzi. Nesse contexto, ROS gerado pela Nox auxiliam na infecção intracelular, uma vez que esta é prejudicada pela inibição da enzima ou pela adição de antioxidante. Em contrapartida, o H2O2 promove a diferenciação através da ativação de PP2A e a infecção intracelular de T. cruzi.