Criopreservação e avaliação da capacidade biossintética de Hovenia dulcis Thunb. (Rhamnaceae) - Paula, Aline Medeiros Saavedra de (2022)
Hovenia dulcis é uma espécie arbórea que vem sendo objeto de estudos biotecnológicos devido às suas propriedades medicinais, como as atividades hepatoprotetora e antineoplásica. Protocolos de micropropagação, calogênese e suspensões celulares já foram estabelecidos para a espécie. Considerando que o material mantido in vitro está sujeito a contaminações e perda do seu potencial morfogenético a criopreservação, que consiste no armazenamento de material biológico a temperaturas ultrabaixas com o uso de nitrogênio líquido (NL), tem sido indicada como um método seguro para a conservação de germoplasma em longo prazo. Este trabalho teve como objetivos desenvolver um protocolo de criopreservação para ápices caulinares de H. dulcis, empregando a técnica de V-Crioplaca, assim como avaliar a manutenção da capacidade de produção de metabólitos secundários do material criopreservado. Plantas propagadas in vitro mantidas em meio de cultura Murashige e Skoog (MS) suplementado com 0,5 mg L−1 de benzilaminopurina (BA) + 0,5 mg L−1 de cinetina (KIN) foram usadas como fontes de explantes para os ensaios de criopreservação. Ápices caulinares excisados de microestacas desenvolvidas por 3 semanas em cultivo, forneceram explantes para os ensaios de criopreservação. Adicionalmente, o melhor protocolo encontrado para ápices excisados de microestacas foi também testado para ápices excisados diretamente das plantas matrizes. Os ápices foram pré-tratados em meio MS contendo 0,3 M de sacarose por 24 h e, em seguida, foram aderidos às crioplacas utilizando soluções de alginato de sódio e cloreto de cálcio. Posteriormente, os ápices foram expostos à solução a base de glicerol e sacarose (solução de osmoproteção ou loading) por 20 min em temperatura ambiente e, finalmente, à solução de vitrificação de plantas número 2 (PVS2) a 0oC por diferentes tempos (0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 min), antes do armazenamento em NL. Para o reaquecimento, as crioplacas foram transferidas para solução de reaquecimento (unloading:1,2 M sacarose) por 20 min em temperatura ambiente. Após a criopreservação, os ápices foram removidos das crioplacas e inoculados no meio MS contendo a associação de BA e KIN, em igual concentração, (0,2 ou 0,5 mg L−1). Adicionalmente, foi avaliado o uso de papel de filtro sobre o meio de cultura como base para a inoculação dos ápices durante a primeira semana de recuperação após a criopreservação. As culturas foram gradativamente expostas à luz, até completarem 1 mês ápos o processo criogênico. A eficiência da criopreservação foi avaliada com base na sobrevivência (após 4 semanas) e recuperação (após 8 semanas) dos ápices caulinares criopreservados. Ápices caulinares expostos em longos tempos de incubação ao PVS2 (90; 120 min) resultaram no aumento das taxas de recuperação. A concentração de citocininas no meio de recuperação influenciou a regeneração dos ápices após a criopreservação. As taxas mais elevadas de regeneração (63%) foram encontradas em meio de cultura MS suplementado com a combinação de BA e KIN (0,5 mg L−1) em associação ao uso de papel de filtro sobre o meio de recuperação . Foram alcançadas taxas de sobrevivência e de recuperação de 68% e 63%, respectivamente para ápices oriundos de microestacas, enquanto para ápices obtidos diretamente das plantas matrizes esses valores foram de 75% e 45%, respectivamente. As plantas regeneradas a partir dos ápices criopreservados apresentaram características fenotípicas semelhantes às propagadas in vitro, demonstrando a eficiência do protocolo de criopreservação de ápices de Hovenia dulcis pela técnica de VCrioplaca. As análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) revelaram a ocorrência de perfis fitoquímicos similares entre materiais oriundos de plantas in vitro e folhas de plantas de campo, sugerindo que o processo de criopreservação não acarretou em alterações na capacidade biossintética das plantas.