Peptidases do Trypanosoma cruzi e Rhodnius prolixus: implicações funcionais na interação - Uehara, Lívia Almeida (2014)
A glicoproteína gp63 consiste na metalopeptidase mais abundante em Leishmania, amplamente distribuída na família Trypanosomatidae e está particularmente envolvida na interação parasito-hospedeiro. Os homólogos de gp63 nos tripanossomatídeos monoxênicos parecem ser essenciais para a nutrição, bem como para interação com células epiteliais do inseto do hospedeiro. Nesse contexto, esse projeto visa através de uma abordagem bioquímica, investigar o perfil proteolítico do extrato celular de Trypanosoma cruzi, visando à detecção da gp63 na cepa Dm28c, analisar o papel dessa metalopeptidase na interação do T. cruzi com um inseto vetor, Rhodnius prolixus, bem como caracterizar o perfil proteolítico de peptidases do triatomíneo. Em última instância, esse conjunto de abordagens permitirá avaliar a relevância das peptidases do parasito e do inseto no processo de interação. Para tal, foram analisados os efeitos do pré-tratamento do T. cruzi com inibidores de metalopeptidases ou anticorpos anti-gp63 na taxa de adesão do parasito ao epitélio intestinal médio posterior dissecado de R. prolixus. A taxa de adesão foi reduzida na presença de 1,10-fenantrolina 0,5 µM (79%), EDTA 1 µM (74%) e EGTA 1 µM (68%) em comparação aos parasitos não tratados. O tratamento de parasitos com 1,10-fenantrolina apresentou um efeito dose-dependente sobre a taxa de adesão em relação aos parasitos não tratados. Além disso, o tratamento de epimastigotas com anticorpos anti-gp63 (1:500) induziu uma redução significativa de 65% na adesão. Não houve diferenças significativas na exposição de gp63 e da cruzipaína quando as células foram tratadas com o inibidor 1,10-fenantrolina por 1 h ou 24 h em relação às células não tratadas. Em contrapartida, a exposição da gp63 pelo T. cruzi teve um aumento drástico após a passagem in vivo em R. prolixus. No extrato celular total de T. cruzi, extraído na presença de inibidores de cisteína-, serina- e aspártico-peptidases, foram identificados três halos de degradação da gelatina típicas do parasita. Um mais proeminente de aproximadamente 52 kDa, classificado como metalopetidase, uma vez que a atividade foi inibida em pH alcalino por 1,10-fenantrolina 20 mM conjugada com EDTA e EGTA a 5 mM. Também foram identificadas uma metalopeptidase com atividade menos proeminente, que migra em torno de 60 kDa e uma banda de atividade bem fraca que consiste de cisteína peptidase que resistiu a extração na presença de inibidores específicos, totalmente inibida por E-64. Esses resultados em conjunto demonstram a presença de metalopeptidases ativas no parasito, possivelmente envolvidas na interação com o inseto vetor. Em relação à caracterização de peptidases ativas de R. prolixus, o perfil proteolítico mostrou ser composto por três bandas migrando na faixa de 31 e 24 kDa no intestino de adultos machos e fêmeas. As peptidases pertencem à classe de cisteína peptidases (fortemente inibidas por E-64), com atividades ótimas na faixa de pH ácido (4,5) e identificadas com 24 h de incubação. Em adição, ensaios com o substrato Z-Phe-Arg-AMC mostraram maior aumento no nível de atividade em pH ácido (5,5). Coletivamente, nossos resultados sugerem uma possível participação de metalopetidases, particularmente da gp63 na interação entre T. cruzi com o intestino do inseto vetor.