Papel pró-tumoral da trombospondina-1 (TSP-1) em modelos de células de adenocarcinoma mamário - Fernandes, Laila Ribeiro (2019)
A trombospondina-1 (TSP-1), o primeiro inibidor fisiológico da angiogênese a ser caracterizado em 1990, possui papel controverso na angiogênese tumoral e na metástase. O domínio N-terminal da TSP-1 (NTSP-1) é pró-angiogênico e nossos trabalhos em modelos endoteliais sugerem que ele potencializa a ação de fatores de crescimento (FCs) angiogênicos através de seus receptores tirosina-quinase (RTKs). Dada a importância do N-terminal na interação da TSP-1 com células tumorais, torna-se essencial definir se tais eventos também ocorrem nessas células. Selecionamos as linhagens MCF-10A (hiperplásica), MCF-7 (tumoral; não invasiva) e MDA-MB-231 (tumoral; invasiva), que foram caracterizadas quanto à expressão de receptores para o domínio NTSP-1, com o objetivo de avaliar suas respostas respostas funcionais ao EGF, cujo RTK (EGFR) foi o único consistentemente detectado nas três linhagens mamárias. As células foram tratadas com EGF ou NTSP-1, além de uma combinação de ambos, nos seguintes ensaios funcionais: (i) “wound healing” (migração coletiva); (ii) migração individual; (iii) análise de proliferação e morte celular; (iv) diferenciação em esferoides 3D (exceto MDA-MB-231); (v) ativação de EGFR e de ERK1/2. Mudanças expressivas foram detectadas nos parâmetros individuais de migração de cada linhagem, ressaltando: células MCF-10A e MDA-MB231 tratadas com NTSP-1/EGF exibiram maior distância acumulada, se comparadas com células tratadas com EGF. Nas células MCF-7, os tratamentos com EGF e NTSP-1/EGF induziram as maiores velocidades de migração. A análise de trajetórias, para as três linhagens, sugere que as respostas a NTSP-1 estão relacionadas à aquisição de padrões de migração randômicos, relacionados na literatura ao comportamento metastático. Não foram observadas modificações importantes na homeostase da proliferação e morte celulares nas células MCF-10A e MDA-MB-231, enquanto o tratamento NTSP-1/EGF estimulou a proliferação de células da linhagem MCF-7. A análise das linhagens MCF-10A e MCF-7 em ambiente tridimensional (3D) evidenciou transições morfológicas importantes em ambas, mas apenas nas células MCF-7, o NTSP-1 potencializou a mudança induzida pelo EGF nos esferoides, para fenótipos em cachos e em colar de contas, ambos considerados menos diferenciados e/ou mais migratórios. Investigamos a via canônica RasRafMEKERK1/2, ativada por EGFR. NTSP-1 e EGF não pareceram atuar com sinergismo na ativação do EGFR e de ERK1/2 nas linhagens MCF-10A e MDA-MB-231, mas uma forte tendência de potencialização de ERK1/2 pelo NTSP-1/EGF foi observada na linhagem MCF-7, com redução do nível total de EGFR, sugerindo o aumento da sua endocitose, o que foi confirmado por microscopia confocal, com a observação de persistência da co-localização de EGFR com Rab5A (marcador de endossoma primário) até 60 minutos, apenas com o tratamento NTSP-1/EGF, sugerindo que o NTSP-1 prolonga a ação do EGF nessas células. Ensaios da via de ERK em células MCF-7, nos quais NTSP-1 foi substituído por TSP Hep II, um peptídeo bioativo ligante de sindecan-4, demonstrou tendência de maior ativação da via. Em ensaios clonogênicos, o tratamento com TSP Hep II, isolado ou em combinação com EGF, levou à formação de colônias de menor diâmetro e de aspecto celular disperso. Por fim, caracterizamos a potencialização de outro FC, FGF-2, na resposta angiogênica dependente de FGFR1, em CEs microvasculares. Nossos dados reforçam hipótese de um papel pró-tumoral e pró-angiogênico para domínio N-terminal da TSP-1 presente no microambiente de tumores mamários, em sinergia com FCs