Desenvolvimento de biossensores eletroquímicos visando a detecção de biomarcadores relacionados ao carcinoma de córtex adrenal pediátrico e à doença de Alzheimer - Lima, Dhésmon (2020)
A presente tese descreve a preparação, caracterização e potenciais aplicações de biossensores eletroquímicos à base de materiais carbonáceos e inorgânicos. Imunossensores baseados em nanopartículas de ouro funcionalizadas com L-arginina (AuNPs-ARG) foram aplicados na detecção label-free do hormônio sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEAS), um biomarcador de carcinoma de córtex adrenal (CCA). O CCA é uma neoplasia rara e de natureza agressiva, caracterizada pela superprodução de DHEAS, e cujos casos pediátricos ocorrem na região Sul do Brasil em níveis acima da média mundial. A plataforma foi construída a partir da modificação de eletrodos de carbono vítreo oxidados com as AuNPs-ARG, e subsequente ligação de anticorpos monoclonais IgM anti-DHEA. As AuNPs-ARG foram obtidas por redução do complexo [AuCl4]- com D-glucose na presença de ARG, e caracterizadas por espectroscopia UV-VIS, FTIR, MET, DLS, potencial zeta e DRX. Os imunossensores foram caracterizados por voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE), e sua construção foi otimizada por meio de planejamentos fatoriais e metodologia de superfície de resposta. A detecção de DHEAS foi realizada por EIE, a partir da variação percentual da resistência à transferência de carga (ΔRct) relativa ao marcador eletroquímico [Fe(CN)6]3-/4-, após imunoensaios na presença do hormônio. Uma relação linear entre a ΔRct e a concentração de DHEAS foi verificada na faixa de 10,0 a 110,0 μg dL-1, com um limite de detecção igual a 7,4 μg dL-1. Além da boa sensibilidade, o imunossensor apresentou exatidão, especificidade e estabilidade durante o período de um mês. O dispositivo foi eficazmente aplicado na análise de amostras de plasma de pacientes, fornecendo resultados equivalentes ao método de quimioluminescência (p > 0,05). Além dos imunossensores descritos, biossensores baseados em eletrodos de ouro (AuE) modificados com sequências de DNA foram desenvolvidos para a detecção de eventos de interação com três isoformas de apolipoproteína E (ApoE2, ApoE3 e ApoE4), as quais relacionam-se com o desenvolvimento da doença de Alzheimer (DAlz) em pacientes idosos. Os oligonucleotídeos empregados consistiram nas sequências promotoras denominadas CLEAR (associada com a expressão de proteínas envolvidas em processos de autofagia celular) e SIRT1 (relacionada com a expressão da proteína neuroprotetora sirtuína-1 (Sirt1)), e foram separadamente imobilizados sobre o AuE na forma de monocamadas auto-organizadas mistas com 6-mercaptohexanol. A interação de tais promotores sobretudo com a ApoE4 tem sido apontada como um dos eventos que pode contribuir para o desenvolvimento da DAlz, a partir de falhas em mecanismos celulares autofágicos e na expressão da proteína Sirt1, favorecendo a deposição cerebral de agregados proteicos tóxicos que levam progressivamente à demência, como placas senis do peptídeo β-amiloide e emaranhados neurofibrilares de formas hiperfosforiladas da proteína tau. Os biossensores foram caracterizados por voltametria de pulso diferencial (VPD), VC, EIE e cronocoulometria, na presença do marcador redox [Ru(NH3)6]3+. As interações dos oligonucleotídeos com as isoformas de ApoE foram avaliadas por VPD e EIE, a partir de variações percentuais na corrente de pico catódico e na Rct após incubação dos biossensores na presença de cada isoforma. Verificou-se que a sequência SIRT1 apresentou uma maior afinidade com a ApoE4 em comparação à ApoE2 e ApoE3, enquanto que a sequência CLEAR interagiu especificamente com a ApoE4, comprovando possíveis efeitos repressores desta isoforma na expressão de proteínas envolvidas em mecanismos celulares neuroprotetores, o que pode favorecer o início da DAlz. Assim, os resultados obtidos na presente tese evidenciaram aplicações promissoras dos biossensores desenvolvidos como ferramentas para diagnóstico clínico de ACC e para a avaliação de interações proteína-DNA envolvidas na DAlz.