Otimização dos ensaios de triagem de compostos tripanocidas - Delvoss, Cleyson Mathias Morais (2019)
Atualmente poucos fármacos estão disponíveis para o tratamento da doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Destes fármacos, a maioria causa severos efeitos colaterais e nenhum deles apresenta 100% de cura parasitológica. A triagem de novos compostos anti-T. cruzi são iniciados com testes in vitro contra epimastigotas e amastigotas intracelulares. Para as formas amastigotas, clinicamente relevantes por apresentarem-se no hospedeiro mamífero, o efeito tripanocida é principalmente avaliado pela contagem microscópica de parasitos residuais. Apesar de reprodutível, esta técnica é morosa e depende da experiência do microscopista. Este trabalho objetiva a padronização de um método de triagem de compostos tripanocidas através da detecção de fluorescência emitida por TcGFP. Epimastigotas da cepa Y (108 parasitos/ml) cultivados em meio LIT+10%SFB foram transfectados com o plasmídeo pROCKGFPNeo e selecionados por diluição seriada e pelo antibiótico de resistência G418. Após seleção, os epimastigotas mostraram expressão de GFP homogênea e estável. A expressão da GFP também se manteve estável em tripomastigotas e amastigotas intracelulares. A transfecção não afetou os padrões de replicação in vitro dos epimastigotas, nem sua suscetibilidade ao benzonidazol e também não alterou a capacidade da cepa de infectar e de se replicar em células Vero E6. Através de fluorimetria foi verificado que há correlação direta entre intensidade de fluorescência e concentração de epimastigotas (R2=0,9986) e amastigotas intracelulares (R2=0,9559) de TcGFP. Para validar a técnica fluorimétrica para triagens de compostos tripanocidas, epimastigotas e células contendo amastigotas intracelulares de TcGFP foram incubados com diferentes concentrações de benzonidazol por 48 e 24 horas, respectivamente. Os resultados mostraram que para epimastigotas o método proposto restringe-se a teste de compostos que causem a lise dos parasitos, devido a possibilidade de detecção da fluorescência emitida pela GFP retida em parasitos inviáveis não lisados. Para as formas amastigotas intracelulares, o método fluorimétrico proposto pode ser aplicado, substituindo a morosa contagem microscópica.