Proteases de Beauveria bassiana : indução e polimorfismo genético - Gimenes, Danielle Cardoso (2024)
Resumo: Beauveria bassiana é um fungo entomopatogênico muito estudado e aplicado no controle de insetos-praga O mecanismo de infecção envolve a produção de enzimas extracelulares que degradam a cutícula do inseto As proteínas são os principais constituintes da procutícula dos insetos, devido a isso, as proteases desempenham um importante papel na penetração cuticular Proteases podem ser induzidas em cultivos submersos na presença de indutores de natureza proteica e poucos estudos foram realizados sobre análise de polimorfismos de genes envolvidos com proteases e outros fatores de virulência do fungo B bassiana Deste modo, o objetivo deste trabalho foi induzir a produção de proteases extracelulares e avaliar a ocorrência de polimorfismos nos genes codificadores de proteases de B bassiana A cepa CG432 de B bassiana foi cultivada em meio mínimo de Vogel suplementado com os indutores: cutícula de cigarras, larvas de Aedes aegypti, caseína, quitina, gelatina, ureia e os aminoácidos metionina, prolina, alanina e glicina e inoculado à 16 esporos mL-1, mantidos a 28°C, 2 rpm durante 5 dias Extratos enzimáticos obtidos pela centrifugação foram analisados quanto ao teor de proteínas, produção de biomassa e atividade de proteases Dos substratos analisados nos meios de cultura, a cutícula de cigarras, as larvas de Aedes aegypti e a caseína apresentaram maior atividade de proteases e, entre os aminoácidos, a metionina foi que apresentou melhor resultado Entre esses indutores a cutícula e as larvas foram os que induziram maior atividade específica da enzima e a caseína contribuiu para o maior crescimento da biomassa fúngica Posteriormente três indutores foram escolhidos: larvas de Aedes aegypti, caseína e metionina e a influência destes, na produção de proteases, foi avaliada utilizando um delineamento de misturas composto por 7 ensaios com 2 repetições no ponto central O micro-organismo foi cultivado em meio de Vogel suplementado com os indutores e inoculado à 16 esporos mL-1, mantido a 28ºC, 15 rpm por 5 dias Extratos enzimáticos obtidos foram analisados quanto à atividade de proteases e sua atividade específica, ao teor de proteínas, produção de biomassa e especificidade da enzima Entre os indutores analisados, as larvas de A aegypti induziram uma maior atividade de proteases, como também a atividade específica desta enzima, a caseína influenciou no aumento da produção de biomassa fúngica e a adição dos três indutores aumentou o teor de proteínas Em todos os ensaios contendo larvas de Aedes aegypti houve a produção de proteases tipo-subtilisina (Pr1) Para a análise do polimorfismo nos genes codificadores de proteases, foram utilizadas 16 cepas de B bassiana isoladas de diferentes insetos e origens geográficas, foi realizada a extração do DNA, amplificação e sequenciamento A amplificação dos genes que codificam proteases resultou em um produto de aproximadamente 4 pb para todas as cepas testadas, os fragmentos amplificados foram sequenciados e as sequências utilizadas para a montagem de um dendrograma, onde foi analisado o polimorfismo genético entre as cepas A análise indicou a formação de dois agrupamentos diferentes, sendo que essa variabilidade genética não foi correlacionada com a atividade de protease, inseto hospedeiro e origem geográfica