Análise proteômica diferencial de Rhizobium tropici CIAT899 em resposta ao aminoácido L-triptofano - Yokoyama, Cátia Lie (2024)
Resumo: Rhizobium tropici CIAT899 é uma bactéria simbiótica utilizada como inoculante comercial para o cultivo de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L) A simbiose entre rizóbios e plantas leguminosas resulta na formação de nódulos radiculares, órgãos especializados na troca de nutrientes entre as bactérias e a raiz aprimorando os benefícios da fixação biológica de nitrogênio (FBN) O estabelecimento da simbiose e formação dos nódulos é um processo complexo e regulado por ambos os parceiros, sendo o fitormônio auxina (ácido indol-3-acético; AIA), um dos fatores envolvidos na regulação do processo de biogênese do nódulo A ação do AIA já foi relatado atuação durante os estágios iniciais do processo de infecção, como o encurvamento do pêlo radicular, desenvolvimento do cordão de infecção, iniciação e diferenciação de nódulos Este fitormônio também é produzido por bactérias, inclusive por R tropici CIAT899, porém as vias de biossíntese e os fatores de regulação são ainda pouco estudadas Entre os fatores conhecidos que regulam a produção de AIA em bactérias está o precursor das vias de biossíntese, o aminoácido L-triptofano (TRP) Além do TRP, a produção de auxinas também é regulada pela disponibilidade de amônia (NH4+), um fator que interfere tanto na biossíntese de auxinas quanto no estabelecimento da simbiose e nodulação de leguminosas Devido à importância de AIA no estabelecimento de relações simbióticas entre rizóbios e leguminosas, o presente trabalho teve como objetivo analisar a produção de auxinas de CIAT899 na presença de TRP e amônia e comparar o proteoma de CIAT899 na presença e na ausência de TRP, visando identificar proteínas que sejam reguladas por este aminoácido Para os ensaios experimentais, CIAT899 foi cultivada em meio YM em quatro condições biológicas (sem TRP; com TRP; com NH4+; com TRP e NH4+), com três repetições A produção de auxinas foi avalizada por colorimetria com o reagente de Salkowski e o crescimento pela absorbância (DO6nm) Para análise protômica, as proteínas foram extraídas e digeridas com tripsina e os peptídeos obtidos foram analisados por cromatografia líquida em nano escala, acoplado à espectrometria de massa (nanoLC-MS/MS) As proteínas foram identificadas pela comparação do proteoma contra o genoma de CIAT899, sendo as proteínas diferencialmente expressas identificadas pela análise de T-fold no programa PatternLab As análises funcionais foram feitas com o auxílio das ferramentas Uniprot, KEGG Mapper e PATRIC Os dados obtidos revelaram que a produção de auxinas em CIAT899 é estimulada pelo L-triptofano, produzindo 28,56 µg/mL em 24 horas de cultivo enquanto a presença de amônia tem efeito negativo com reduções de até 61,2% A amônia é o principal produto da FBN e age como o principal regulador nas etapas finais de simbiose e nas reações envolvidas com a FBN, reforçando a importância da elucidação do papel do AIA nestes processos Na análise diferencial, entre YM versus YM+TRP, foram identificadas 617 proteínas totais, no qual 164 foram exclusivamente expressas na ausência de TRP, e 112 na presença de TRP Na análise utilizando KEGG permitiu mapear mais de 9 vias metabólicas, onde a via com maior número de identificações foi relacionado à biossíntese de metabólitos secundários Na análise utilizando o GO foram identificadas principalmente proteínas relacionadas à atividade catalítica, biossíntese de compostos celulares, e processos metabólicos e celulares A análise no TFold permitiu identificar 1 proteínas diferencialmente expressas que satisfazem ambos testes estatísticos (fold-change e p-value), 28 proteínas atenderam apenas o corte de Fold change e 8 proteínas que são consideradas diferencialmente expressas, mas apresentaram baixa abundância Entre as proteínas diferencialmente expressas, destacam-se a fosfatase ácida, lactato desidrogenase, proteína periplásmica de ligação oligopeptidica, transportador ABC, proteína do locus B associada com invasão, succinoglucana ExoF, proteína da via de dissimilação da Fucose e três proteínas ribossomais 5S Os principais processos que foram alterados em resposta ao aminoácido triptofano foram: metabolismo de sideróforo, biossíntese de polissacarídeos de superfície celular, atividade de quimiotaxia e motilidade e biossíntese e metabolismo de aminoácidos aromáticos por CIAT899 Estes resultados evidenciam que a biossíntese de AIA ocorre por vias metabólicas dependentes de TRP que são reguladas pela disponibilidade de amônia