Quantificação de óxido nítrico em músculo estriado esquelético de ratos através de quimiluminescência : modelos de lesão por isquemia-reperfusão e caquexia induzida por tumor de Walker-256 - Iamamoto, Cristiane Akemi (2024)
Resumo: A participação do óxido nítrico (•NO) e do peroxinitrito (ONOO-) tem sido sugerida na lesão por isquemia-reperfusão (LIR) do músculo esquelético e, recentemente, na caquexia associada ao câncer Em virtude das dificuldades encontradas na quantificação do •NO, avaliações indiretas de sua síntese têm sido utilizadas, freqüentemente, para a investigação de efeitos atribuídos ao •NO tanto em condições fisiológicas, como patológicas A produção de •NO foi diretamente detectada no músculo esquelético, nos modelos experimentais de LIR e caquexia induzida por tumor de Walker-256, através de um método de quimiluminescência altamente sensível e específico Ratos Wistar machos adultos foram submetidos a 4 h de isquemia induzida pela aplicação de torniquete na extremidade proximal da pata posterior esquerda, acompanhada por 1 (IR1), 2 (IR2) ou 4 (IR4) h de reperfusão NG-nitro-L-arginina metil éster (LNAME – 2 mg/kg), aminoguanidina (AG – 5 mg/kg) ou desferrioxamina (DFO – 6 mg/kg) foi administrado intraperitonealmente (ip) 1 h antes do início da reperfusão A caquexia foi induzida em ratos pelo tumor de Walker-256, através da inoculação subcutânea (sc) de 8x17 células tumorais na porção lateral da pata posterior direita Estes animais foram divididos em 4 grupos, de acordo com o tempo decorrido após o implante do tumor: 3 (T3), 5 (T5), 1 (T1) ou 14 dias (T14) Para eliminar o efeito da redução de ingestão alimentar apresentada pelos grupos experimentais, foram realizados grupos controles PBS / Pair Fed Cada grupo experimental foi comparado com o respectivo grupo controle PBS / Pair Fed LNAME (2 mg/kg) ou AG (5 mg/kg) foi administrado ip diariamente até o 5° dia após o implante do tumor Em ambos os modelos, os músculos astrocnêmios esquerdos foram removidos e homogeneizados (,5% m/v) com Na2CO3 2mM, pH 8,5, degaseificado pelo N2, diluídos 2 vezes e adicionados à mistura de reação (luminol 4,39 µM, DFO 36,58 µM e H2O2 2,44 mM, 25oC) A solução padrão de •NO foi utilizada para a curva de calibração (2,8-355,55 aM) A altura e a área sob as curvas de quimiluminescência foram utilizadas para a quantificação de •NO As concentrações de •NO (média ± EPM fmol / g de tecido) encontradas na LIR foram: Controle (4,73 ± ,24); Isquemia (4,16 ± ,99); IR1 (4,26 ± ,32); IR2 (5,84 ± 1,27); IR4 (18,25 ± 2,4); IR4AG (8,8 ± ,69); IR4LNAME (3,33 ± ,298); IR4DFO (2,83 ± ,3) A perda de massa muscular (%) foi utilizada como indicador den caquexia: PBS / Pair Fed 5 (-7,56 ± 1,3); PBS / Pair Fed 1 (5,26 ± ,38); PBS / Pair Fed 14 (9,11 ± 1,2); T3 (7,36 ± 2,76); T5 (11,63 ± 2,21); T5LNAME (16,71 ± 3,28); T5AG (11,24 ± 1,13); T1 (35,38 ± 1,6); T14 (33,9 ± 2,37) As concentrações de •NO nestes animais foram: PBS / ad libitum (4,81 ± ,18); PBS / Pair Fed (5 2,52 ± ,25); PBS / Pair Fed 1 (1,96 ± ,14); PBS / Pair Fed 14 (1,84 ± ,11); T3 (1,35 ± ,15); T5 (5,2 ± ,48); T5LNAME (2,6 ± ,18); T5AG (2,41 ± ,2), T1 (1,92 ± ,8); T14 (2,13 ± ,32) Houve aumento da concentração de •NO após 4 h de reperfusão, sendo significativamente inibido pela AG e bloqueado pelo LNAME e pela DFO Estes resultados revelam o envolvimento do •NO após 4 h de reperfusão e confirmam estudos prévios em nosso laboratório mostrando o aumento de hidroperóxidos lipídicos e da expressão de iNOS no músculo após 4 h de reperfusão, mas não após a isquemia No modelo de caquexia, houve redução da concentração de •NO em T3, aumentando significativamente em T5 Este aumento foi bloqueado pelo uso de LNAME ou AG O aumento no 5o dia ocorreu, possivelmente, pela ativação de iNOS pelo TNF-a, conforme verificado por outros autores A partir do 1o dia, não houve qualquer alteração da concentração de •NO Houve aumento da concentração de hidroperóxidos lipídicos em T5, que foi significativamente diminuído por ambos os inibidores de NOS, demonstrando o envolvimento do •NO na peroxidação lipídica observada no músculo esquelético Esta é a primeira evidência direta da geração e participação do •NO na LIR do músculo esquelético Nossos resultados mostram, ainda, o envolvimento do •NO na lesão peroxidativa observada no músculo esquelético de ratos com caquexia induzida pelo tumor de Walker-256