Obtenção e utilização de anticorpos policlonais para análise de protease de Aggregatibacter actinomycetemcomitnas à imunoglobulina G em periodontites e infecção experimental em camundongos - Nakanishi, Fernanda Akemi (2024)
Resumo: Aggregatibacter actinomycetemcomitans está freqüentemente associado a vários quadros de periodontites e infecções não orais Há controvérsias quanto aos dados de nível de imunoglobulinas específicas em pacientes com periodontites, o que pode ser decorrente da ação de protease de A actinomycetemcomitans O objetivo do trabalho foi obter e utilizar os anticorpos policlonais para a análise de protease à IgG humana em isolados de A actinomycetemcomitans, avaliar nível de IgG específica, analisar efeito de sobrenadante de cultivo de A actinomycetemcomitans no nível de IgG específica em salivas de pacientes com periodontites, avaliar nível de protease à imunoglobulina G no decorrer da infecção experimental em camundongos Foram obtidos inicialmente anticorpos policlonais de coelho e de camundongos por imunização dos mesmos com a fração cromatográfica de sobrenadante de cultura de Aa ATCC 43718 com atividade de protease Os anticorpos obtidos foram analisados por western blotting (WB) e por cromatografia em coluna de sephadex G-15 Esses anticorpos policlonais foram utilizados para determinar níveis de protease em amostras de sobrenadante de cultivo de isolados provenientes de pacientes com periodontite agressiva localizada (PAL) e com periodontite ulcerativa necrotizante associada à síndrome da imunodeficiência adquirida (PUN/SIDA), por ELISA captura Adicionalmente foi realizada a análise de nível de IgG anti-protease em amostras de salivas de pacientes com PAL e controles saudáveis e o efeito de sobrenadante de cultura de cepa de referência (ATCC 43718) no nível de IgG anti-leucotoxina em salivas de pacientes com PAL utilizando ELISA indireto Utilizando a mesma metodologia foi realizada a análise de nível de protease em tecidos e plasma além de anticorpo específico em camundongos BALB/c infectados por inoculação bucal de A actinomycetemcomitans (ATCC 43718 sorotipo b) nos dias 15, 3 e 6 pós-infecção Os resultados obtidos demonstraram que os anticorpos interagem com antígeno de ~5kDa por WB, sendo capazes reconhecerem as frações cromatográficas contendo atividade de protease Por ELISA captura, foi observado nível similar de protease nos isolados com PAL e PUN/SIDA Por ELISA indireto foi observado nível significativamente mais elevado de IgG anti-protease em grupo de salivas de pacientes com PAL em relação ao grupo saudável e após a incubação de salivas com sobrenadante de cultura houve decréscimo no nível de IgG específica em todas as amostras analisadas Em camundongos infectados foram observados níveis significativamente elevados de protease em tecidos e no plasma, sendo em nível maior na fase inicial da infecção para amostras de gengiva palatal enquanto que os níveis cardíaco e cerebral foram maiores na fase mais tardia (6 dias) Foi observado também aumento significativo no nível plasmático de IgG anti-protease em nível mais elevado no período de 15/3 que 6 dias pós-infecção Concluímos pelos resultados obtidos que a protease presente no sobrenadante de cultura de A actinomycetemcomitans possivelmente apresenta MM de ~5 kDa, que os níveis de protease à IgG são similares entre os isolados provenientes de pacientes com PAL e PUN/SIDA, que ocorre aumento no nível salivar de IgG específica e que os níveis de anticorpos específicos podem sofrer decréscimo pela atuação de sobrenadante de cultivo de A actinomycetemcomitans, sugerindo potencial desse microrganismo em alterar título de anticorpos na saliva Concluímos também que a infecção bucal de camundongos com A actinomycetemcomitans induz aumento no nível de protease à IgG, tanto localmente como de forma sistêmica e, se esse aumento interfere na diminuição de IgG específica à A actinomycetemcomitans no decorrer da infecção, requer estudos adicionais