Padronização de metodologias para o estudo funcional de genes em Pratylenchus brachyurus e caracterização da proteína PB6584.1 envolvida no parasitismo - Nomura, Rafael Bruno Guayato (2024)
Resumo: Pratylenchus brachyurus é atualmente o segundo principal fitonematoide na cultura da soja no Brasil Considerando que as atuais práticas agronômicas para o controle deste patógeno não tem alcançado êxito, o desenvolvimento de variedades resistentes se apresenta uma alternativa promissora Atualmente, a metodologia de RNA interferente (RNAi) constitui uma importante ferramenta para o estudo funcional de genes em diferentes espécies De maneira geral, estudos de RNAi em fitonematoides são conduzidos tanto in vitro, via soaking, como in vivo, através de plantas geneticamente modificadas para expressarem moleculas de RNA dupla fita (dsRNA) Recentemente,a adminstração das moléculas de dsRNA in planta, sem a necessidade de transformação genética, vem sendo testada em vários patossistemas Esta é conhecida como Aplicação Ectópica (AE),e se baseia na absorção direta do dsRNA pela planta Embora seu uso em estudos envolvendo fitonematoides ainda não tenha sido descrito, os resultados em insetos evidenciam seu potencial para utilização em outros organismos O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial de utilização dessas metodologias (Soaking e AE) para o estudo de genes em P brachyurus, em especial da proteína PB65841, potencialmente envolvida no estabelecimento da parasitismo Inicialmente, o método de soaking foi avaliado, sendo utilizadas moléculas de dsRNA não complementares aos transcritos do nematoide como controle para os testes A capacidade de ingestão das moléculas de dsRNA foi determinada pela incubação dos nematoides em solução contendo dsRNA, octopamina (neuroestimulante) e marcadores de ingestão (FITC e dsRNA ligado ao fluorocromo Cy-3) Após a incubação, foram observados sinais de fluorescência no estilete e glândula esofágica, indicando que os nematoides foram capazes de ingerir o dsRNA Para a avaliação da metodologia de AE, foi realizada a absorção radicular de dsRNA-GFP em plantas de soja Foram avaliados o transporte do dsRNA através do tecido vegetal, bem como sua estabilidade ao longo do tempo, sendo o dsRNA detectado após 6 dias da infecção Esses resultados demonstram o potencial dessas metodologias para o estudo de genes nesse nematoide Para a caracterização da proteína PB65841, foi avaliado o perfil de expressão do gene ao longo do ciclo infeccioso, indicando a ativação da transcrição do candidato já no tempo de 12h após a infecção Adicionalmente, o efeito do silenciamento do gene foi avaliado por ambas as metodologias, medindo-se a capacidade de multiplicação dos nematoides em cilindros de cenoura, após o soaking, e em plantas de soja, via soaking e AE das moleculas de dsRNA no solo Após 6dai, foi avaliado o fator de reprodução (FR) de cada planta, não sendo observada diferença significativa entre os tratamentos (controle e PB65841) As análises de expressão do gene candidato demonstraram a ocorrência de silenciamento gênico em ambos os métodos Assim, mais estudos se fazem necessários visando o estabelecimento de um método baseado em RNAi, para o estudo funcional de genes em P brachyurus