Avaliação do efeito citotóxico do citral sobre células de melanoma murino metastático B16F10 - Sanches, Larissa Juliani (2024)
Resumo: O melanoma representa 4% dos cânceres de pele registrados no Brasil Quando diagnosticado precocemente pode ser removido cirurgicamente, mas quando a doença encontra-se disseminada é comum ser refratária às terapias disponíveise as terapias oferecidas são apenas paliativas A resistência observada muitas vezes está associada a uma menor suscetibilidade à apoptose e alterações nas vias de proliferação e sobrevivência celular As espécies vegetais são fontes de compostos naturais que apresentam atividades de interesse na preservação da saúde e no tratamento de doenças, varias classes de compostos químicos já foram descritos em literatura, mas alguns compostos como o citral foram pouco estudados O citral é um aldeído alifático de ocorrência natural e é encontrado na forma de mistura isomérica de neral (cis) e geranial (trans) Por apresentar aroma de limão é utilizado como aromatizante de alimentos, bebidas e doces, assim como na produção de fragrâncias para artigos cosméticos e de higiene Apesar de existirem poucos estudos com o citral, os existentes exibem atividades antiproliferativa e/ou citotóxicas sobre algumas linhagens de células neoplásicas O presentre trabalho avaliou o efeito do citral sobre células murinas de melanoma metástatico (B16F1), cultivadas a 2x15 em placas de 24 poços, em meio de cultura Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco), suplementado com 5% de soro fetal bovino (SBF, Gibco) e ,1% de solução antibiótica e antimicótica (Santa Cruz) e incubadas em estufa (Sanyo) a 37º C, com 5% de CO2 com umidade controlada de 95% As células foram expostas ao citral por 24 horas nas concentrações,1; ,5; 1,e 2,5µM, todos os experimentos foram realizados juntamente como grupo controle com DMSO na concentração de 1% em culturaApós o período de tratamento, observamos redução na viabilidade célular a partir da concentração ,5 µM O IC5 foi estimado em 1,4 µM para 24 horas de tratamento e em ,77 µM para 48 horasForam realizados ensaios de citotoxicidade e proliferação celular através do teste por exclusão com azul de Tripan O citral foi capaz de reduzir a viabilidade a partir da concentração ,5 µM para 24 e 48h, enquanto a proliferação celular reduziu a partir da concentração ,5 µM para 24h e ,5 µM para 48h, sugerindo efeito antiproliferativo nas concentrações ,5 e ,1 µM para 48h Para determinar os padrões de morte celular estavam envolvidos, realizamos o teste de diferencial de morte com brometo de etídio/larajado de acridina(BE/LA), o teste de TUNEL para confirmar apoptose, o Lactato desidrogenase (LDH) liberado no meio de cultura para avaliar a necrose No teste de coloração diferencial BE/LA o citral foi observado padrão apoptótico de morte celular a partir da concentração ,5 µM e foi confirmado pelo teste TUNEL O padrão necrótico foi observado a partir da concentração 1, µM, confirmado pela dosagem de LDH Avaliamos a formação de vacúolos autofágicos através da coloração com monodansilcadaverina (MDC) e observamos indução de autofagia na concentração 1, µM A indução de lesão de DNA foi avaliada pelo teste do Cometa em pH alcalino, onde foi observada indução de lesão a partir de ,5 µM Para determinar os parâmetros de estresse oxidativo realizamos a dosagem de glutationa reduzida (GSH), de malondialdeído (MDA), sendo observado consumo de GSH a partir da concentração ,5 µM e aumento de MDA para concentração 2,5 µM Para avaliar as espécies reativas envolvidas dosamos os níveis de óxido nítrico (NO) e utilizamos conhecidos sequestradores de espécies reativas de oxigênio (Tempol, trolox e L-histidina), onde observamos uma redução significativa dos níveis de NO e proteção contra o efeito citotóxico do citral para todos os sequestradores utilizados Para verificar se o citral apresenta atividade oxidante direta realizamos o teste de consumo de oxigênio induzido por T-butil hidroperóxido em eritrócitos, onde não observamos efeito oxidativo direto do citral Para elucidar a capacidade do citral de interferir em vias de sinalização intracelular, realizamos ensaios de imunocitoquimica para a proteínas ERK1/2, Pi3K,Akt, p53 e NFkB O citralfoi capaz de diminuir os níveis de marcação imunocitoquímica para ERK1/2 celular na concentração 1, µM e nuclear nas concentrações ,5 e 1, µM Para as marcações de Pi3K e a Akt também observamos diminuição nas concentrações ,5 e 1,µM, enquanto para a p53 observamos aumento da marcação nas concentrações ,5 e 1, µM O citral foi capaz de aumentar a marcação de NFkB celular na concentração 1,µM e diminuir a marcação nuclear do NFkB nas concentrações ,5 e 1, µM Finalmente para verificar a citotoxicidade do citral sobre células normais, cultivamos e tratamos as células de fibroblastos murino NIH-3T3nas mesmas condições que as células B16F1 e observamos que citral também induz citotoxicidade com IC5 24h estimado em 2,5 µM Nossos resultados concordam com resultados obtidos por outros autores para outras linhagens de células tumorais Confirmamos que o mecanismo de ação do citral envolve aapoptose e as proteínas p53 e NFkB, e acrescentamos o envolvimento de autofagia, do estresse oxidativo e das proteínas ERK 1/2 e Pi3K O citral não apresentou seletividade, uma vez que apresente citotoxicidade sobre as células normais NIH-3T3, no entanto estas apresentam uma resistência maior ao citral (IC5de 25 µM 24h) Os resultados promissores in vitroapontam que o citral deve ser investigado in vivo em modelos experimentais de melanoma para averiguar seu efeito antitumoral no melanoma