Purificação e caracterização dos inibidores de amilase em milho (Zea mays L.) visando controle de fusarium verticillioides - Figueira, Edson Luiz Zangrando (2024)
Resumo: O milho (Zea mays L) é uma cultura de interesse mundial envolvendo produção de 583 milhões de toneladas, sendo que o Brasil produz aproximadamente 7% do total Devido as propriedades nutricionais, o milho está sujeito a diversos predadores com ênfase a insetos e fungos micotoxigênicos, destacando-se Fusarium verticillioides Niremberg (F moniliforme Sheldon), por ser contaminante predominante de distribuição mundial, produtor de fumonisina na micoflora Considerando que o controle de fungos em milho seja difícil, pesquisas estratégicas tem como alvo o estudo de compostos envolvidos nos mecanismos naturais de defesa das plantas, citando-se os inibidores de amilase (IA) Esta pesquisa contribuiu com o estudo dos mecanismos naturais de defesa com ênfase a inibidores contra amilase de F verticillioides, assim como de insetos predadores relevantes na agricultura, visando o melhoramento genético do milho A triagem de inibidores de amilase (IA) contra amilase de F verticillioides foi realizada em 37 híbridos O nível de IA variou de 5,5 a 16, unidades inibidoras de amilase (UIA/g) por grama de milho nos híbridos MASTER e AG511, respectivamente O híbrido com maior atividade inibidora de amilase foi utilizado na purificação da nova proteína por precipitação fracionada com (NH4)2SO4, cromatografia de filtração em gel (Sephadex G-75), Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em coluna de Superose HR 1/3 e troca aniônica em CLAE, obtendo 2,7 vezes de purificação A massa molecular aparente de 23,8 kDa foi determinada em SDS-PAGE sob condições redutoras com pI ácido de 5,4, diferindo de outros inibidores descritos em milho (14 e 22 kDa) O IA apresentou amplo espectro de atividade, inibindo amilase salivar e pancreática humana, de fungos como F verticillioides e A flavus, de insetos como A obtectus, Z subfasciatus, T castaneum e S cerealella Fusarium spp foi o principal contaminante do milho (81,1% das amostras) com contagem entre 1,5 x 12 a 2,4 x 16 ufc/g de milho, e fumonisina foi detectada em 21 híbridos com concentrações de ,5 a 2,67 µg de FB/g de milho No entanto, a correlação entre o nível de IA nos grãos de milho com a presença de Fusarium spp e fumonisina nas condições experimentais avaliadas não foi significativa Outro IA estudado apresentou alta hidrofobicidade com massa molecular de 19,7 kDa, foi purificado de milho procedendo extração com etanol a 95%, seguida de cromatografia de troca iônica O IA ativo contra Fusarium verticillioides apresentou ponto isoelétrico de 3,6, estabilidade em ampla variação de pH e temperatura, mantendo 47,6% da atividade após tratamento a 94°C por 6 min O IA purificado apresentou alto conteúdo de valina, leucina, glicina, alanina e glutamina/ácido glutâmico, com destaque especial ao teor de valina (41,2%) O inibidor não apresentou carboidrato na estrutura molecular e requereu 3 min de pré-incubação com amilase de F verticillioides, para estabilizar o complexo enzima-inibidor O pH ótimo de interação foi 6,5 e caracterizou-se com amplo espectro de ação, incluindo desde atividade sobre amilase salivar humana, pancreática de porco, F verticillioides, a insetos de interesse agronômico (Acanthoscelides obtectus, Zabrotes subfasciatus, Sitophilus zeamais e Prostephanus truncatus) A nova proteína hidrofóbica demonstrou potencial de utilidade como marcadores moleculares de resistência fúngica, uma vez que também inibe a germinação de conídios de F verticillioides, constituindo em alternativa promissora para minimizar a produção de fumonisina em milho A comparação entre a microbiota fúngica, concentração de fumonisina e nível de IA contra amilase de F verticillioides entre os 21 híbridos do grupo precoce e 16 de ciclo super precoce, não foi estatísticamente significativa (P > ,5), sugerindo que maior ênfase deve ser dada às características inerentes do híbrido conforme interesse particular dos produtores, durante a escolha do ciclo a ser cultivado Em suma, a atividade inibidora não se restringiu apenas a fungos micotoxigênicos relevantes no milho, mas também inibiu enzima de insetos de interesse agronômico, gerando novas perspectivas no estudo desta proteína contra resistência a predadores/fitopatógenos Ie, desenvolvimento de plantas biotecnologicamente melhoradas, com a vantagem de não inibir as amilases de origem humana, aliada a baixa atividade sobre amilase de milho, arroz e cevada