Estudos Bioquímicos de proteases extracelulares e expressão de seus genes de isolados de Trichoderma spp. após crescimento em parede celular de Rhizoctonia solani - Melo, Dayana Rosa de (2012)
Espécies de Trichodermatem sido estudadas principalmente pelo seu reconhecido papel no controle biológico de diversos fitopatógenos, sendo que proteases, glucanases e quitinases estão intrinsecamente envolvidas nesse processo. Esse trabalho objetivou o estudo bioquímico de proteases extracelulares de Trichodermavirens(301/01), Trichoderma harzianum (494/02 e ALL 42)e Trichoderma asperellum (T00) secretadas quando expostas a parede celular de Rhizoctonia solani (PCRS)e analisada a expressão dos genes de proteases, glucanases e quitinases frente à PCRS tendo como controle a indução em glicose. A atividade especifica de proteases de T harzianum foi baixa em comparação a Tvirens eT asperellum, demonstrando a alta capacidade de micoparasitismo dessa espécie, jáque no confronto em placa de petri todos os isolados foram efetivos contra R. solani. Foi utilizada a Cromatografia de afinidade com bacitracina para obtenção dos extratos de proteases, sendo observados perfis diferenciados para os isolados e para pHs 5,0e 8,0. Foi avaliada a influência de inibidores e detergentes na atividade enzimática no extrato de proteases, PMSF e EDTA inibiram os extratos em aproximadamente 20%, Triton X-100 e SDS inibiram em até 25%. A ação de cátions di e monovalentes foi avaliadarevelando um aumento na atividade enzimática em ate 40% e uma dinimuição de 20% respectivamente. Avaliou-se a afinidade dos extratos de proteases em dois substratos, albumina e azocaseína. A afinidade pela albumina foi baixa em relação a azocazeína para todos os isolados. Em relação a temperatura e pH ótimo verificou-se que os extratos apresentaram temperatura ótima em 50°C e pH ótimo a 8,0. Para avaliar o perfil de proteases dos isolados foi realizada uma cromatografia em gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Para avaliar a atividade de proteases em gel de poliacrilamida, ascondiçõesforamnãodesnaturantes (zimograma).A análise da expressão dos genes de proteases foi analisada pela técnica de RT-PCR nos isolados 494/02 e ALL 42 nos tempos de 6, 12, 24 e 48 horas, demonstrando um perfil variando na expressão das proteases trypsin-like, aspartato protease e serino protease. Para analisar a relação da expressão dos genes de proteases e relação à expressão de genes de outras enzimas também envolvidas no micoparasitismo, foi analisada a expressão dos genes de β 1-3 endoglicanase, quitinase 42 kD e N-Acetilglicosaminidase (Nagase) frente a PCRS. O isolado T.harzianum(ALL 42) manteve melhor perfil de expressão de aspartato proteases e de β 1-3 endoglicanase, quitinase 42 kD e N-Acetilglicosaminidase (Nagase). O coeficiente de Pearson foi calculado para correlação entre glucanases, quitinases e proteases, correlações positivas foram observadas para o isolado ALL 42 para aspartato protease e β 1-3 endoglicanase, quitinase 42 kD e N-Acetilglicosaminidase (Nagase), enquanto que 494/02 não demonstrou correlação positiva para aspartato protease.