DEFINIÇÃO DE UM MEIO DE CULTIVO PARA O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CANINOS ISOLADOS - SERAFIM, MICHELLE KAREN BRASIL (2013)
A presente tese teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes concentrações de 1) insulina, 2) GH, associados ou não ao FSH sobre o cultivo de folículos pré-antrais caninos e sua influência na esteriodogênese, e ainda o efeito do 3) EGF na presença ou ausência de FSH, e a influência do meio de base (MEM ou αMEM) em diferentes sistema de cultivo (2D ou 3D). Para tanto, folículos pré-antrais e antrais avançados foram isolados por microdissecção e cultivados por 18 dias em gotas de 100 μL de α-MEM ou MEM suplementado. Para as condições experimentais, nas fases I, II, e III, foram avaliados respectivamente os efeitos da insulina (5, 10 ng/ml ou 10g/mL), GH (10 ou 50ng/ml) e EGF (50 ou 100 ng/ml) na ausência ou presença de concentrações crescentes de FSH (100, 500 e 1000 ng/mL), adicionados sequencialmente a partir dos dias 0, 6 e 12 de cultivo, respectivamente. Na Fase 3, foi ainda avaliado os meio de base MEM ou αMEM, cultivados no sistema 2D, 3D em matriz de alginato ou 3D em matriz de alginato associado à fibrina. Durante o cultivo foram avaliados os seguintes parâmetros: crescimento folicular, formação de antro, extrusão e crescimento oocitário. Após o cultivo, foi analisada a viabilidade folicular (marcadores calceína e etídio homodímero), bem como a integridade da cromatina com o Hoechst 33342. Na Fase I,a suplementação com insulina a 10g/mL associada ao FSH apresentou média do diâmetro folicular, taxa de formação de antro e sobrevivência significativamente superiores aos demais tratamentos (P <0,05). Referente à Fase II, o crescimento folicular no grupo com GH a 50ng/ml associado ao FSH apresentou maior diâmetro folicular (P˂ 0,05), bem como taxas de formação de antro significativamente superior ao Controle. Os folículos oriundos do Controle e do GH 50ng/ml associado ao FSH apresentaram um aumento significativo da produção de estradiol, do dia 6 ao dia 18 de cultivo. Na Fase III, a taxa de crescimento folicular, bem como o percentual de oócitos com cromatina intacta ao fim do cultivo foram superiores (P˂ 0,05) no tratamentos MEM acrescido de EGF 100ng/ml associado ao FSH, quando comparado aos demais tratamentos. Os folículos cultivados em meio base αMEM demonstraram uma taxa de crescimento significativamente superior (P< 0.05) aos demais tratamentos. Vale salientar que não foi observada influência do sistema de cultivo (2D ou 3D) sobre o desenvolvimento folicular. Concluindo, este estudo mostrou que a insulina, GH, e EGF de forma dose dependente beneficiam a manutenção da morfologia folicular e sua associação ao FSH estimulou o desenvolvimento folicular in vitro. Palavras chaves: cadela, folículo ovariando, cultivo in vitro, oócito