Cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos na presença de fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF-9) e fatores de crescimento fibroblásticos 2 e 10 (FGF-2 e FGV-10) - Almeida, Anderson Pinto (2011)
Os objetivos deste estudo foram: (1) quantificar a expressão de RNAm para GDF-9 em folículos ovarianos e verificar seu efeito, isoladamente ou associado ao FSH, sobre o crescimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos (FOPAS) isolados (Experimento I); (2) quantificar a expressão de RNAm para FGF-2 em folículos ovarianos, localizar sua proteína no tecido ovariano, além de verificar o efeito de sua adição no cultivo in vitro de folículos pré-antrais isolados caprinos (Experimento II) e; (3) avaliar os efeitos do FGF-10 e/ou FSH, sobre o crescimento in vitro de FOPAs caprinos cultivados em fragmentos de tecido ovariano (Experimento III). Para avaliação da expressão de RNAm e proteínas, foram utilizadas as técnicas de RT-PCR em tempo real e imunohistoquímica, respectivamente. FOPAs isolados caprinos foram cultivados na presença de diferentes concentrações de GDF-9, associado ou não ao FSH (Experimento I), por 18 dias, ou ainda na presença de FGF-2 por 12 dias (Experimento II). Vale ressaltar que os folículos cultivados com GDF-9 foram destinados à maturação in vitro ao término do cultivo. Para avaliação da eficiência do cultivo, foram considerados os parâmetros: viabilidade, formação de antro e crescimento folicular para ambos os experimentos, e também a configuração da cromatina nuclear oocitária para o GDF9. No terceiro experimento, foi realizado o cultivo in vitro de FOPAs por 16 dias, inclusos em fragmentos de tecido ovariano, na ausência ou presença FGF-10 e/ou FSH, adicionados em diferentes momentos (primeira e/ou segunda metade) do cultivo (meio dinâmico). Neste experimento, foram observados os percentuais de folículos normais e em crescimento. Para avaliação do cultivo in situ, foram utilizadas as técnicas de histologia clássica e microscopia eletrônica de transmissão. No que diz respeito ao Experimento I, foi observado um aumento significativo na expressão de RNAm para o GDF-9 ao longo do desenvolvimento folicular inicial, sendo maior em folículos pré-antrais secundários do que em primordiais e primários. Já para os folículos antrais, esta expressão foi significativamente superior nos complexos cúmulus-oócitos (CCOs), quando comparada às células da granulosa/ teca. A adição de GDF9 no cultivo in vitro, melhorou as taxas de sobrevivência e crescimento folicular, e promoveu a formação precoce do antro somente na ausência do FSH. No tocante ao Experimento II, somente foi observada diferença significativa na expressão de RNAm para o FGF-2 em grandes folículos antrais, onde os CCOs apresentaram níveis de expressão significativamente inferior às células da granulosa/teca. A expressão de sua proteína foi identificada como moderada em folículos pré-antrais e forte, moderada e fraca em oócitos, células da granulosa (cúmulus) e células da teca de folículos antrais, respectivamente. Quanto ao cultivo, a adição de FGF-2 promoveu um aumento significativo na taxa de crescimento diária. No cultivo in situ (Experimento III), o tratamento iniciando com FSH (dia 0 ao 8) e terminando FGF-10 (dia 8 ao 16), manteve o percentual de folículos normais, favoreceu a ativação folicular, e foi capaz de manter a integridade ultraestrutural após 16 dias de cultivo. Concluindo, foi observada a expressão do RNAm para GDF-9 e FGF-2 ao longo do desenvolvimento folicular, com a proteína FGF-2 podendo ser encontrada de maneira diferenciada entre folículos pré-antrais e antrais. A adição do GDF-9, na ausência de FSH, exerceu um efeito benéfico sobre a sobrevivência e desenvolvimento in vitro, bem como o FGF-2 promoveu aumento da taxa de crescimento de folículos pré-antrais isolados caprinos. O cultivo de fragmentos de tecido ovariano em meio dinâmico, iniciando com FSH e terminando com FGF-10 foi capaz de promover a manutenção da viabilidade folicular e o desenvolvimento de FOPAs caprinos até o estádio de folículo primário. Palavras-chave: Expressão gênica. Cultivo in vitro. Folículos pré-antrais. Caprinos.