Espermadesinas caprinas (bodesinas): produção em sistema bacteriano - Cajazeiras, João Batista (2009)
A baixa eficiência de purificação e da caracterização incompleta das espermadesinas (Bdhs) caprinas (Capra hircus) nos levou a estabelecer um sistema eficaz para produzir as recombinantes (Bdhs). O cDNA da Bdh-2 e Bdh-4 foi inserido para ser expresso em um procarioto com plasmídio pTrcHis TOPO. O sistema pTrcHis-Bdh foi construído para produzir a proteína fusionada com a His6-tag em células de Escherichia coli Top 10. Os clones recombinantes foram selecionados através de crescimento em meio contendo ampicilina, amplificação por PCR e sequencia de nucleotídeo. Os insertos de cDNA foram completamente identificados e a síntese da proteína recombinante foi monitorada através de SDS-PAGE seguido por immunobloting usando anticorpo monoclonal anti histidina. A expressão das ambas rBdhs foi observada utilizando concentrações de IPTG nas concentrações de 0,1 até 2,0 mM e após incubação de 2 até 6 horas. A maior produção das rBdhs ocorreu com 1,5 mM IPTG após 2 horas de indução e com 0,3 mM de IPTG após 4 horas de cultivo. Entre os tempos de indução investigado, 6 horas mostrou os menores níveis de produção para Bdh-2 e Bdh-4, onde não se observou diferenças entre as diferentes concentrações de IPTG testado. O peso molecular aparente para Bdh-2 foi de 15,85 KDa e para Bdh-4 foi de 18,17 KDa. Esse resultado está de acordo com os teóricos peso molecular de 15,5 KDa para Bdh-2 e 16,5 KDa para Bdh-4 a partir da sequencia nucleotídica. Antes deste estudo, a expressão da espermadesina recombinante em caprinos (Capra hircus) nunca tinha sido relatad. Assim, um sistema eficaz de expressão de rBdh em procariótico foi estabelecido a fim de proporcionar uma boa ferramenta para estudar a biofunção de espermadesinas caprinas. Palavras-chave: Caprino, espermadesina, proteína recombinante