Perfil de trimetilação da H3K4 e H3K9 em folículos caprinos crescidos in vivo e in vitro: impacto da adição do anetol e da utilização do meio condicionado ou meio específico para células-tronco mesenquimais - Silva, Ana Flavia Bezerra Da (2024)
Esta tese objetivou determinar os padrões de metilação (H3K4me3 e H3K9me3) e transcritos para as demetilases (KDM1AX1, KDM1AX2 e KDM3A) em folículos ovarianos caprinos antes (in vivo) e após cultivo in vitro, considerando a presença ou ausência de anetol, meio condicionado (MC) ou meio para células-tronco mesenquimais da geleia de Wharton (CTMs-GW). No primeiro estudo, folículos ovarianos pré-antrais (FOPAs) tardios isolados foram cultivados por 6 dias em meio α-MEM+ na ausência ou presença de anetol, enquanto FOPAs tardios e folículos ovarianos antrais (FOAs) iniciais não cultivados serviram como controles. Após o cultivo, os FOPAs tardios e FOAs iniciais foram avaliados quanto aos padrões de metilação (H3K4me3 e H3K9me3); abundância de RNAm para genes associados a apoptose (BAX e BCL2), esteroidogênese (CYP17 e CYP19A1) e demetilação (KDM1AX1, KDM1AX2 e KDM3A); morfometria e níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs). No segundo estudo, foram utilizados FOPAs iniciais (primordial, transição, primário e secundário) inclusos em tecido ovariano in vivo (dia 0) ou cultivados in vitro por 1 ou 7 dias em meio α-MEM+ na ausência ou presença de MC-CTMs-GW. No terceiro estudo, os FOPAs iniciais inclusos em tecido ovariano foram cultivados por 1 ou 7 dias em meio folicular ou meio para CTMs-GW. Nos dois últimos estudos foram avaliados padrões de metilação (H3K4me3 e H3K9me3) e transcritos para as demetilases (KDM1AX1, KDM1AX2 e KDM3A), sobrevivência, crescimento dos folículos/oócitos, densidade das células estromais, apoptose, níveis de tióis reduzidos e EROs; e apenas no segundo estudo, quantidade de lipofuscina e fibras de colágeno I e III. O nível de significância estatística para todos os estudos foi definido como P<0,05. No primeiro estudo, os padrões de metilação e a abundância de RNAm para os genes associados à apoptose, esteroidogênese e demetilação foram semelhantes entre FOPAs tardios e FOAs iniciais crescidos in vivo e diferentes entre FOAs iniciais crescidos in vitro vs. folículos crescidos in vivo. O padrão de H3K4me3 foi maior no tratamento anetol comparado aos controles não cultivados ou cultivados. No segundo estudo, in vivo, transcritos para demetilação foram detectados e os padrões de metilação foram semelhantes entre as categorias foliculares. Comparado ao controle cultivado, o MC-CTMs-GW aumentou percentuais de folículos normais em crescimento, diâmetros dos folículos/oócitos, densidade das células estromais e padrão de H3K4me3, além de diminuir marcadores de estresse oxidativo, taxas de apoptose das células da granulosa e padrão de H3K9me3. No terceiro estudo, comparado ao meio folicular (controle cultivado), o meio para CTMs-GW apresentou maior taxa de sobrevivência folicular e maiores diâmetros de folículos/oócitos; e menores níveis de tióis reduzidos e EROs. Em conclusão, in vivo, os padrões de metilação e abundância de RNAm para os genes associados a apoptose, esteroidogênese ou demetilação foram semelhantes entre FOPAs tardios vs. FOAs iniciais (estudo I), bem como entre as categorias de FOPAs iniciais (estudo II). Ao comparar o crescimento folicular in vivo vs. in vitro, regulações distintas nos padrões de metilação e nas abundâncias de RNAm foram detectadas nos tratamentos anetol (estudo I), MC (estudo II) ou meio para CTMs-GW (estudo III). Em geral, o MC ou meio específico para CTMs tiveram impactos positivos no cultivo folicular nos parâmetros de sobrevivência e crescimento folicular/oocitário, densidade das células estromais, taxas de apoptose, níveis de tiois reduzidos e EROs.