Avaliação da criopreservação e ativação de espermatozóides de carpa comum, Cyprinus carpio L. em meio a base de água de coco em pó, (ACP-104) utilizando análise computadorizada e sondas fluorescentes - Carvalho, Maria Audália Marques de (2013)
O presente estudo teve por objetivos avaliar o comportamento cinético e osmótico dos espermatozoides (sptz) frescos de carpa comum, Cyprinus carpio diluídos em água de coco em pó (ACP-104) combinado aos crioprotetores dimetilsulfóxido (DMSO) e metilglicol (MG), avaliar o ACP-104A (150 mOsmol/kg H2O) como solução de ativação e verificar a integridade da membrana de sptz congelados em ACP-104 através do uso das sondas fluorescentes diacetato de carboxifluoresceína (DACF) e iodeto de propídio (IP). O sêmen formando pools foi misturado aos diluentes ACP- 04 (pH 8.0; 300 mOsmol/ kg H2O) + DMSO e ACP-104 + MG. As amostras diluídas foram envasadas em palhetas de 0,5 ml e congeladas em vapores de nitrogênio líquido a -170 ºC em Dry Shipper e estocados em nitrogênio líquido a -196 ºC. Os sptz descongelados a 25 ºC por 30 segundos foram avaliados sem uso de ativador e após adição das soluções ativadoras ACP-104A (150 mOsmol/kg H2O) ou NaCl (100 mOsmol/kg H2O) quanto à cinética através da análise computadorizada (CASA). A motilidade foi registrada após 10s da ativação quanto à motilidade total (% MT) e velocidades, sendo analisados 200 sptz/campo. O teste de comparações múltiplas demonstrou que o sêmen congelado em ACP-104+DMSO resultou em melhores motilidade e velocidades, assim como a solução ativadora ACP-104A apresentou os melhores resultados de motilidade pósdescongelação quando comparada à solução NaCl (p > 0,05). No segundo experimento, o sêmen criopreservado em ACP-104+DMSO e Alsever+DMSO foi submetido ao teste de integridade de membrana através das sondas fluorescentes diacetato de carboxifluoresceína (DACF) e iodeto de propídio (IP). Alíquotas de 10 [l de sêmen descongelado foram colocadas em quatro tubos Eppendorf de 1,5 ml, protegidos da luz, contendo 100 [l de uma das soluções ACP-104, ACP-104A, NaCl e Alsever, com 300, 150, 100, e 150 mOsm/kg H2O, respectivamente. Cada um recebeu 5[l de DACF e, após cinco minutos de incubação, foram adicionados 10 [l de IP, incubando-se por mais cinco minutos no escuro. Alíquotas de 10 [l de cada tubo foram avaliadas entre lâmina e lamínula, em microscópio de epifluorescência (400x), quanto ao percentual de sptz íntegros (cor verde pelo DACF) e danificados (cor vermelha pelo IP). Duzentos sptz foram contados em cada lâmina. Houve uma redução significativa no percentual de sptz móveis no sêmen congelado (36,12 ± 1,9%) em relação ao sêmen fresco (93,0 ± 6,2%) quando ativados nas diferentes soluções. O percentual de sptz móveis em foi de 35,94 ± 17,96% no diluente ACP-104 e 32,14 ± 18,87% em meio de Alsever, respectivamente (p>0,05). Contudo, não houve diferença significativa entre os diluentes, nem entre as soluções ativadoras. Um elevado grau de danos foi observado através do teste de integridade de membrana com CFDA/IP, sendo este teste eficiente na detecção de danos celulares e na predição da viabilidade de sptz criopreservados em ACP-104, juntamente com o teste de motilidade objetiva pelo CASA. Diversos estudos serão ainda necessários para o aperfeiçoamento do protocolo usando o Dry Shipper como método de congelação para reduzir o percentual de aglutinação e aumentar o percentual de sptz íntegros.  Palavras-chave: Água de coco e pó, sondas fluorescentes, integridade membrana, ativação.