Transferência nuclear de células somáticas (TNCS) em ruminantes: aspectos moleculares e produção de embriões - Pereira, Alexsandra Fernandes (2010)
O sucesso da produção de animais clones por Transferência Nuclear de Células Somáticas (TNCS) envolve múltiplas etapas e cada uma destas pode influenciar a eficiência final da técnica. Assim, para investigar fatores relacionados à TNCS em ruminantes, esse trabalho teve como objetivos: (i) avaliar o efeito de um protocolo alternativo de estimulação ovariana (dose única de FSH e eCG) sobre a maturação nuclear e expressão de EGF/EGFR em oócitos e células do cumulus oriundos de cabras submetidas à laparoscopia, quando comparado ao tratamento padrão (múltiplas doses de FSH), (ii) investigar a resposta aos danos de DNA em embriões bovinos produzidos por fecundação in vitro (FIV), ativação partenogenética (AP) e TNCS através da detecção quantitativa da histona H2A.X, (iii) produzir e transferir embriões obtidos por Handmade Cloning (HMC) utilizando células doadoras derivadas de um caprino transgênico para o Fator Estimulante das Colônias de Granulócitos humano (hG-CSF). Em ambos os protocolos para estimulação ovariana, nenhuma diferença foi observada entre o número de oócitos recuperados por animal (11,74,9 vs.10,84,3), percentual de complexos cumulus-oócito (CCOs) GI/GII e GIII (73,9% vs.70,1% e 14,2% vs. 16,8%) e taxa de maturação (49,1% vs. 46,1%) para os regimes padrão e dose única, respectivamente (P>0,05). Por outro lado, os CCOs produzidos em ambos os tratamentos foram diferentes com relação à expressão de EGF e EGFR. Interessantemente, a maturação in vitro aumentou a expressão de EGFR em oócitos e células do cumulus. Quanto à resposta aos danos ao DNA em embriões bovinos pré-implantacionais, em estádios iniciais do desenvolvimento, pronúcleo 1 (pronúcleo maior) de embriões fecundados mostraram um número de foci de H2A.X/núcleo quatro vezes maior que em núcleo de embriões 1-cell de TNCS (309,5±70,2 vs. 73,7±17,6, respectivamente, P<0,05). Por outro lado, ambos os parâmetros (número de foci de H2A.X/núcleo e área de cromatina danificada/núcleo) foram maiores em blastocistos derivados de AP quando comparados aos embriões FIV e TNCS (P<0,05). Tal ocorrência refletiu numa alta taxa de blastocistos partenotos quando comparado com os outros grupos (FIV e TNCS). Em relação à dinâmica da H2A.X durante o desenvolvimento em embriões produzidos pelos diferentes processos, ambos os parâmetros não difereriram entre embriões fecundados (1-célula e 2-células). Interessantemente, blastocistos produzidos por FIV mostraram uma redução em relação aos dois parâmetros quando comparado a embriões 1-célula (134,7±30,6 vs. 493,0±111,1 para o número de H2A.X focus/núcleo e 1511,8±365,0 vs. 11491,7±3046,8 pixels para a área da cromatina danificada/núcleo, respectivamente, P<0,05). Em relação ao desenvolvimento de embriões TNCS, a área da cromatina danificada/núcleo em embriões clones foi reduzida em blastocistos quando comparado a embriões precoces (1622,1±641,4 vs. 3074,3±654,8 vs. 12578,9±6014,5 para blastocistos, 1- célula e 2-células, respetivamente, P<0,05). Quanto à produção de embriões caprinos clones por HMC, a taxa de clivagem, mórula e blastocisto em embriões reconstruídos foram de 87,3% (131/150), 18,0% (27/150) e 12,7% (19/150), respectivamente. Nenhuma receptora recebendo embriões reconstruídos foi diagnosticada prenhe no 35º dia. Em conclusão, a TNCS é uma técnica multifatorial e os progressos em todas as suas etapas contribuem de maneira significativa para simplificar e melhorar sua eficiência. Palavras-chave: Ruminantes. TNCS. EGF. EGFR. H2A.X. Handmade Cloning. Transgênese.