Análise da morfologia, viabilidade e ultraestrutura de folículos pré-antrais após vitrificação do tecido ovariano ovino - Lunardi, Franciele Osmarini (2012)
A criopreservação ovariana tem como principal objetivo o armazenamento em baixas temperaturas deste tecido para posterior utilização, garantindo preservação do material biológico de mulheres e fêmeas de animais de alto valor genético. Embora extensamente estudada, diversos pontos ainda necessitam ser elucidados, como a definição de técnicas de e soluções de vitrificação que garantam a preservação ideal, quantitativa e qualitativa, de folículos ovarianos. Além disso, ainda não foram obtidos resultados consistentes, na espécie ovina, inerentes ao cultivo do tecido criopreservado. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo comparar a eficiência de técnicas e de soluções de vitrificação sobre a preservação da morfologia, da ultraestrutura e da viabilidade em folículos préantrais inclusos em tecido ovariano ovino, bem como verificar a viabilidade desses folículos previamente vitrificados após cultivo in vitro de curta duração. Para tanto, fragmentos ovarianos foram criopreservados utilizando-se as técnicas vitrificação em macrotubos (VMT), superfície sólida (VSS) e vitrificação convencional (VC), combinadas a seis soluções, contendo 6 M de etilenoglicol (EG), com ou sem sacarose (SAC) (0,25 ou 0,50 M) e/ou 10% de soro fetal bovino (SFB). Após uma semana de armazenamento em nitrogênio líquido, as amostras foram aquecidas e a análise histológica foi realizada mostrando que a percentagem de folículos normais após a VC (66,20 ± 8,87%), utilizando a solução contendo 6 M EG, 0,25 M SAC e 10% SFB foi semelhante a encontrada em córtex ovariano fresco (79,40 ± 7,83%), após VMT (53,40 ± 10,60%) e após VSS (56,75 ± 15,33%), ambos com a mesma solução (P <0,05). Para avaliação da viabilidade folicular, fragmentos ovarianos foram vitrificados, mais uma vez, utilizando as técnicas e solução descritas acima. Após o aquecimento, os folículos foram avaliados com o corante azul de tripan e, o maior percentual de folículos viáveis foi observado após VMT (97,06%), valor semelhante ao do controle fresco (92,62%) (P <0,05), porém, significativamente superior ao encontrado após VSS (81,08%) e após VC (83,81%) (P <0,05). A microscopia eletrônica de transmissão confirmou estes resultados, já que folículos ultraestruturalmente normais foram identificados apenas após VMT e no tecido fresco ou não vitrificado. Além disso, folículos submetidos à VMT com a solução composta por 6 M EG, 0,25 M SAC e 10% SFB, combinação entre a melhor técnica e a melhor solução, foram avaliados quanto à viabilidade após 48 h de cultivo in vitro. Esta análise foi realizada por microscopia de fluorescência, na qual os folículos isolados a partir de fragmentos do tecido fresco foram imediatamente analisados como controle fresco ou foram submetidos a 48 h de cultivo in vitro antes da análise, enquanto outros fragmentos foram vitrificados/aquecidos e, imediatamente, analisados ou, ainda, submetidos a 48 h de cultivo in vitro antes da análise. Após o cultivo, procedeu-se a incubação desses folículos com marcadores fluorescentes (calceína-AM e homodímero de etídio-1). Embora a vitrificação e/ou cultivo in vitro tenham reduzido o percentual de folículos viáveis se comparado ao grupo controle fresco (100%) (P <0,05), o percentual de folículos vitrificados em fragmentos de tecido ovariano (65%), ou cultivados in vitro por 48 h com (36,5%) ou sem (62,5%) prévia vitrificação foram semelhantes (P> 0,05), assim, a viabilidade folicular após 48 h de cultivo in vitro não foi afetada após VMT com esta solução. Em conclusão, a VMT com 6 M EG, 0,25 M SAC e 10% SFB é a combinação mais eficiente, entre técnicas e soluções testadas no presente estudo para a criopreservação de tecido ovariano ovino. Palavras-chave: Vitrificação. Folículo pré-antral. Cultivo in vitro. Etilenoglicol. Ovário.