Purificação do vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) em camarão marinho da espécie Litopenaeus vanname e desenvolvimento de técnicas sorológicas para o seu diagnóstico - Melo, Maria Verônyca Coelho (2011)
O objetivo deste estudo foi purificar e caracterizar o agente viral da mionecrose infecciosa (IMN), através de técnicas de baixo custo. Para tanto, foram utilizados camarões oriundos de duas carciniculturas no interior do Ceará, que apresentavam sintomas da mionecrose. As amostras foram estocadas a -20°C, e encaminhadas para o Centro de Estudo e Diagnóstico de Enfermidades do Camarão Marinho-CEDECAM; do Instituto de Ciências do MarLabomar/UFC, para diagnóstico definitivo através de RT-PCR usando primers específicos para o IMNV, segundo o fabricante. Os resultados mostraram bandas em eletroforese em gel de agarose 2%, correspondendo a amplicons de 328pb e outra 372pb. Camarões positivos foram utilizados para purificação do IMNV na presença de tampão fosfato, pH 7,5 enriquecido com antioxidantes. Após maceração em um mixer a suspensão foi clarificada com clorofórmio e/ou n-butanol, submetida à centrifugação diferenciada, e precipitada com polietileno glicol (PEG) em presença de cloreto de sódio (NaCl). O precipitado foi ressuspenso em tampão fosfato e depositado em um gradiente descontínuo de sacarose. Uma banda correspondendo ao IMNV purificado foi detectada na camada de sacarose 40 % (m/m). A banda foi então submetida a RT-PCR seguida de eletroforese em agarose 1% (m/m) em que foi detectado o mesmo amplicon encontrado nos camarões infectados. Uma eletroforese em poliacrilamida (SDS-PAGE) revelou bandas de proteínas características do IMNV. O fragmento do genoma viral foi sequenciado de forma bidirecional, utilizando-se os primers IMNV-Foward e IMNV-Reverse pelo método modificado de Sanger. As sequências analisadas foram confirmadas pelo acesso do GenBank: AY57098.1 e EF061744.1, mostrando 99% de identidade nucleotídica com as sequências encontradas no GenBank. Com a finalidade de induzir resposta imune humoral. Foram utilizados dois modelos animais: camundongos swiss e coelho da raça Nova Zelândia. Grupos de dez camundongos foram imunizados por via subcutânea com 200µg do IMNV na presença do adjuvante incompleto de Freund; sendo que todos os camundongos receberam 20µg. Em relação aos coelhos, a imunização por via subcutânea foi realizada utilizando bandas protéicas do vírus purificado que estavam presentes em macerado de geis de poliacrilamida. A reatividade dos anticorpos policlonais produzidos em camundongos e coelho contra extrato bruto de camarões infectados, extrato de camarão purificado com IMNV e extrato de camarões sadios foi detectada através de Western blotting. Elisa e Dot blot que confirmaram a especificidade dos anticorpos contra a proteína estrutural do IMNV. No entanto, os anticorpos não reagiram com o extrato bruto de camarão não infectado. Estes resultados sugerem métodos fáceis para produzir antissoros específicos para o diagnóstico viral em grande escala. Além do mais, a produção de anticorpos policlonais poderá ser utilizada na fabricação de um kit de diagnóstico por ser uma estratégia rápida, especifica e eficaz. Palavras chaves: Litopenaeus vannamei, IMNV, sequenciamento.