ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA O VÍRUS DA ARTRITE-ENCEFALITE CAPRINA - Brandão, Camila Fonseca Lopes (2013)
RESUMO ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA O VÍRUS DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAEV). [CAMILA FONSECA LOPES BRANDÃO] O CAEV, membro da família Retroviridae, gênero Lentivirus, causa doença progressiva e debilitante em caprinos. É um vírus envelopado cujo genoma codifica a poliproteina precursora p55gag que, após clivagem proteolítica, gera as proteínas do core. Este último é formado por uma tripla camada protéica, dentro da qual se encontra a p28, proteína de maior número de unidades repetidas e com importante papel na produção de resposta imune. Na infecção, a resposta de anticorpos é lenta e em alguns casos a soroconversão pode ocorrer após vários meses. O teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) para a detecção de anticorpos possui uma baixa sensibilidade, principalmente nos estágios iniciais da infecção, o que tem estimulado a busca por técnicas mais sensíveis e que possam detectar precocemente a infecção. Muitas técnicas sorológicas utilizam Anticorpos Monoclonais (AcM), com especificidade única e que consistem em ferramentas de grande uso para fins diagnósticos ou de pesquisa para agentes virais. Neste trabalho, foram produzidos e caracterizados AcM para o CAEV com potencial aplicação no estudo e diagnóstico. Dentre as características imunológicas, foi demonstrado que todas as imunoglobulinas foram do tipo IgG1, de cadeia leve κ, sem atividade precipitante segundo o IDGA, o que evidencia a sua monovalência. Segundo a técnica de Western-blot, a atividade destes AcM está direcionada para a proteína da cápside (p28) de CAEV, contra o precursor p55gag e os produtos intermediários da clivagem, p44, p36 e p22. O sítio de ligação dos AcM na p28 é um epítopo linear ou contínuo e sem pontes dissulfeto intramoleculares e nas 17 proteínas precursoras da cápside (p55gag, p36 e p22), o epítopo está associado em proteínas diméricas ou que apresentam regiões com pontes dissulfeto, provavelmente ricas em resíduos Cys. A monoespecificidade da detecção da proteína viral foi observada usando células de Membrana Sinovial Caprina (MSC) infectadas, através da Imunofluorescência Indireta (IFI), onde todos os AcM tiveram sinal detectável para o vírus. Os AcM tiveram baixos títulos no Elisa Indireto, e os resultados foram melhorados na técnica de Dot-Blot, onde cinco AcM (G7, B9, A9, H9 e C7) detectaram o CAEV numa concentração proteica igual a 2,675 g, enquanto que o AcM F12 detectou apenas 5,35 g. Ao combinar os AcM na técnica de ELISA Combinado, observou-se uma melhor detecção do CAEV e desta forma, pode-se sugerir o uso combinado de alguns AcM, tais como o AcM A9 com o G7, C7 e o F12. A especificidade demonstrada pelos AcM para reconhecimento antigênico em ensaios imunoenzimaticos, principalmente quando enfrentados com proteínas virais e proteínas celulares, como no caso da IFI, permitiu o desenvolvimento de um processo de detecção de antígeno do Vírus da Artrite-Encefalite Caprina (CAEV) em células do leite de cabras infectadas. Estes resultados levaram a um pedido de patente. Palavras-chave: CAEV, Anticorpos Monoclonais, p28, p55 gag, Agentes Desnaturantes, Caracterização, Imunofluorescência Indireta, Diagnóstico Precoce.