Proteômica de fluido folicular in vivo e o efeito do meio de base, da insulina e da tiroxina no cultivo in vitro de folículos ovarianos - Paes, Victor Macêdo (2020)
Os objetivos da presente tese foram: verificar o efeito de diferentes meios de base suplementados com duas concentrações de insulina sobre o desenvolvimento de folículos secundários e terciários caprinos (Fase I); avaliar o efeito da associação entre tiroxina (T4) e insulina sobre as taxas de sobrevivência e desenvolvimento folicular, produção de estradiol e espécies reativas de oxigênio (EROs), bem como a análise da expressão de genes responsáveis pela apoptose e relacionados aos receptores de insulina e tireóide em folículos primordiais caprinos (Fase II); avaliar a dinâmica do perfil proteico e as análises funcionais do fluido folicular (FF) recuperados de folículos porcino pequeno, médio e grande in vivo (Fase III); avaliar o proteoma do FF de folículos porcino pequeno e grande in vivo, utilizando duas abordagens proteômicas shotgun e baseada em gel (2-DE) (Fase IV). Na Fase I, folículos secundários e terciários foram cultivados in vitro isolados por 18 dias em meio αMEM ou TCM199 suplementado com insulina 10 ng/mL ou 10 µg/mL. Na Fase II, folículos primordiais foram cultivados in vitro inclusos em córtex ovariano por 1 ou 7 dias em meio αMEM suplementado com insulina 10 ng/mL ou 10 µg/mL na presença ou ausência de tiroxina 0,5, 1 ou 2 µg/mL. Na Fase III, FF de folículos porcino pequeno, médio e grande foram destinados a uma análise proteômica livre de gel. Na Fase IV, apenas FF de pequenos e grandes folículos porcino foram submetidos a ambas abordagens proteômicas shotgun e 2-DE. Na Fase I, folículos secundários e terciários cultivados em meio αMEM tiveram respectivamente, melhores taxas de sobrevivência e crescimento que os cultivados em TCM199. Além disso, αMEM acrescido de insulina 10 ng/mL potencializou o crescimento oocitário. A Fase II demonstrou que a associação de insulina e T4 em baixa concentração foi melhor para a manutenção da integridade folicular e dos níveis de EROs. Além disso, os tratamentos que utilizaram insulina 10 ng/mL apresentaram melhores níveis de estradiol e da taxa Bcl2/Bax. Entretanto, a combinação de insulina e T4 em altos níveis aumentaram a ativação e crescimento folicular. A Fase III revelou um aumento no número de proteínas de acordo com o tamanho folicular com 60% das proteínas sendo estágio específica, 12% compartilhadas entre pares e 247 proteínas comuns entre as amostras. Além disso, foram observadas flutuações na categorização funcional de componente celular, função molecular e processo biológico. Na Fase IV, shotgun detectou 4245 proteínas, enquanto 2-DE revelou 2321 spots. Ambas as técnicas tiveram 6 proteínas diferencialmente expressas em pequenos e grandes folículos. As proteínas up-regulated em folículos pequenos estão envolvidas na maturação oocitária, enquanto grandes folículos tiveram uma up-regulation em proteínas que atuam no processo de ovulação. Como conclusão, o meio de base αMEM suplementado com insulina 10 ng/mL melhorou o crescimento de oócitos de folículos secundários e terciários (Fase I); altas concentrações de insulina e tiroxina melhoraram o desenvolvimento de folículos primordiais (Fase II);; a Fase III e IV revelaram uma análise proteômica ampla e funcional do fluido folicular durante o final da foliculogênese.  Palavras-chave: Folículo ovariano. Insulina. Meio de base. Proteômica. Tiroxina